Bài giảng Sinh học - Sự phát sinh phôi soma ở các kiểu gene khoai mì vùng đông bắc brazil

SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA Ở CÁC KIỂU GENE KHOAI MÌ VÙNG ĐÔNG BẮC BRAZILNỘI DUNGGIỚI THIỆUVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNKẾT LUẬN1. GIỚI THIỆUKhoai mì (Manihot esculenta), hay còn gọi là sắn, là một nguồn thực phẩm thông dụng khắp các vùng nhiệt đới trải dài từ Châu Phi, Châu Á đến châu Mỹ.Phương pháp phát sinh phôi soma và phát sinh cơ quan ở cây khoai mì ở vùng Đông Bắc Brazil vẫn còn chưa phát triển.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPCác loại khoai mì trong nghiên cứu này: Água Morna, Amansa Burro, Aparecida, Mata Fome, Milagrosa, Rosa, Rosinha và Sacai Các mẫu cấy sử dụng là các đỉnh chồi phân lập từ các cây trưởng thành in vitro và từ các chồi mọc từ các cành cây nhân giống (stem cuttings). Sự phát sinh phôi soma đạt được tần số cao khi thêm vào môi trường chất kích thích auxin picloram ở khoảng rộng các nồng độ. Các tử diệp (lá mầm) của phôi soma sơ cấp được sử dụng làm các mảnh cấy cho sự hình thành phôi soma thứ cấp trong một môi trường kích thích bổ sung picloram 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNhân giống in vitro sử dụng các đoạn cây giống tươi dài 20-30cm với 5-8 lóng được lấy từ các cây trưởng thành. Các cành này được gieo vào khay plastic (50 x 30 x 8 cm), đổ đầy khoáng và tưới với môi trường ½ muối MS, giữ trong điều kiện nhà kính. Khi các chồi mới mọc cao 2 cm, chúng được cắt từ cây mẹ, đưa vào phòng thí nghiệm, khử trùng bằng cách ngâm vào 1.5% sodium hypochlorite, 0.01% dung dịch Triton X-100 trong 5 phút. Các đỉnh chồi chứa 3 lá sơ khởi được tách vô trùng và chuyển vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MS rắn bổ sung BA 0,1mg/L. Các ống nghiệm chứa mảnh cấy được ủ ở 26±2 ºC trong một một tủ tăng trưởng cài đặt chương trình cho chu kỳ sáng – tối 16/8 giờ, dùng đèn huỳnh quang trắng (25,3 µmol m-2 s-1). Việc nuôi cấy duy trì bằng cách cấy chuyền hàng tháng các mảnh cấy trong cùng điều kiện môi trường.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPĐối với việc kích thích sự sinh phôi soma, các mẫu cấy là các đỉnh chồi chứa 3 lá sơ khởi phân lập từ cây trưởng thành in vitro và từ các cành nhân giống. Các mảnh cấy được chuyển dưới điều kiện vô trùng vào đĩa petri chứa 25 ml môi trường MS rắn bổ sung 2% sucrose, 0.5 mg/L đồng sulphate và picloram nồng độ 1, 3, 6, 9 12 hay 15 mg/L tạo rắn nhờ 0.6% agar. Sau 3 tuần ủ trong tối 26±2 °C, ghi nhận sự hiện diện của phôi soma. Phương pháp mô tả bởi Zhang et al. (2001) sử dụng cho giai đoạn trưởng thành của phôi soma. Cụm gần 10 phôi được chuyển vào đĩa Petri chứa 25 ml môi trường muối MS và vitamin, 2% sucrose, 0.5 mgL-1 đồng sulphate và 0.1 mgL-1 BA, pH 5.8, tạo rắn nhờ 0.6% agar, ủ từ 3 đến 4 tuần ở 26 ± 2ºC dưới chu kỳ sáng là 16h.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPCác lá mầm xanh từ các phôi trưởng thành 2-3 tuần được sử dụng làm nguồn mẫu cấy kích thích sinh phôi soma thứ cấp. Lá mầm được cắt ra thành các mảnh 4 mm2 và chuyển vào đĩa petri chứa 25 mL môi trường MS rắn bổ sung 2% sucrose, 0.5 mgL-1 đồng sulphate và picloram nồng độ 1, 3, 6, 9 12 hay 15 mgL-1, tạo rắn nhờ 0.6% agar. Sau 3 tuần ủ trong điều kiện tối ở 28 ± 2 °C, kết quả được đánh giá theo sự hiện diện của phôi soma.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1. Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa picloram leân söï kích thích sinh phoâi soma töø caùc ñænh choài phaân laäp töø caây in vitro tröôûng thaønh treân 2 loaïi khoai mì laø AÙgua Morna vaø RosinhaQuan saùt maãu caáy sau 10 ngaøy ta thaáy moâ seïo coù khaû naêng sinh phoâi phaân chia phaùt trieån thaønh phoâi ôû giai ñoaïn hình caàu. Töø ngaøy 14 cho ñeán ngaøy 21 cuûa quaù trình uû, phoâi soma ôû giai ñoaïn thuaàn thuïc coù hình caù ñuoái vaø 2 laù maàm ñöôïc nhìn thaáy. (Hình 1)3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNBảng 1 - Ảnh hưởng của nồng ñộ picloram leân sự kích thích sinh phoâi soma từ caùc ñỉnh chồi phaân laäp töø caây in vitro tröôûng thaønh (Manihot esculenta Crantz) cvs. AÙgua Morn vaø Rosinha3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNKeát quaû Baûng 1 cho thaáy picloram coù khaû naêng kích thích sinh phoâi soma cao ñoàng thôøi cuõng cho soá löôïng lôùn caùc phoâi soma treân moät maãu caáy.Ñoái vôùi kieåu gen AÙgua Morna, noàng ñoä picloram 1mg/L cho taàn soá phaùt sinh phoâi soma cuõng nhö soá löôïng caùc phoâi treân moãi maãu caáy laø thaáp hôn raát nhieàu so vôùi noàng ñoä 12 hay 15 mg/L, nhöng khaùc bieät khoâng coù yù nghóa thoáng keâ so vôùi caùc noàng ñoä khaùc. Ñoái vôùi kieåu gen Rosinha, taàn soá phaùt sinh phoâi soma cuõng nhö soá löôïng caùc phoâi treân moãi maãu caáy ôû noàng ñoä picloram 1 vaø 3 mg/L thaáp hôn so vôùi caùc noàng ñoä coøn laïi, khoâng coù söï khaùc bieät quan troïng thoáng keâ naøo ñöôïc tìm thaáy.Ngoaøi ra, AÙgua Morna cho ñaùp öùng toát hôn Rosinha caû trong taàn soá phaùt sinh phoâi soma cuõng nhö soá löôïng phoâi treân moãi maãu caáy.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN2. Khaûo saùt söï kích thích sinh phoâi soma thöù caáp töø caùc ñænh choài phaân laäp töø choài moïc treân caønh nhaân gioáng ôû 8 loaïi khoai mì nuoâi caáy treân moâi tröôøng MS coù boå sung noàng ñoä picloram 4mg/L.Bảng 2: Sự kích thích sinh phoâi thứ cấp từ ñỉnh chồi phaân lập từ caønh nhaân giống trong khoai mì (Manihot esculenta Crantz). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNKeát quaû Baûng 2 cho thaáy phoâi soma ñöôïc kích thích trong taát caû caùc kieåu gen thöû nghieäm. Caû 2 kieåu gen AÙgua Morna vaø Rosinha ñeàu cho taàn soá phaùt sinh phoâi soma cuõng nhö soá löôïng phoâi soma treân moãi maãu caáy thu ñöôïc töø choài ñænh caây in vitro tröôûng thaønh gaàn nhö khoâng khaùc gì so vôùi thu ñöôïc töø caùc choài moïc töø caønh nhaân gioáng. (Baûng 1 vaø Baûng 2)Theo Chakrabarty et al., 2003; Feheùr et al., 2003, khoâng neân söû duïng caây tröôûng thaønh in vitro laø maãu caáy cho kích thích sinh phoâi soma vì thao taùc laâu ngaøy coù theå laøm saûn sinh ñoät bieán do caùc hoaït ñoäng cuûa gen nhaûy. Vì vaäy, söû duïng ñænh choài phaân laäp töø caùc choài moïc treân caønh nhaân gioáng laø nguoàn thích hôïp cho maãu caáy cho kích thích sinh phoâi soma.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3. Khaûo saùt aûnh höôûng noàng ñoä picloram leân söï kích thích sinh phoâi soma thöù caáp töø laù maàm cuûa phoâi soma sô caápSöû duïng laù maàm cuûa phoâi soma sô caáp laøm maãu caáy giuùp tieát kieäm thôøi gian nhaèm cung caáp ñeàu ñaën maãu caáy cho quaù trình kích thích sinh phoâi soma.Bảng 3 - Ảnh hưởng của nồng ñộ picloram leân sự kích thích sinh phoâi soma thöù caáp töø laù maàm cuûa phoâi soma sô caáp caây khoai mì (Manihot esculenta Crantz). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNKeát quaû trình baøy trong Baûng 3 cho thaáy noàng ñoä picloram khoâng aûnh höôûng maïnh leân taàn soá phaùt sinh phoâi soma vaø soá löôïng phoâi treân moãi maãu caáy. So saùnh Baûng 1 vaø Baûng 3, söï kích thích phaùt sinh phoâi soma duø phaân laäp töø ñænh choài hay töø caùc maûnh cuûa laù maàm phoâi soma sô caáp ñeàu khoâng coù söï khaùc bieät lôùn. Töø moãi laù maàm coù ít nhaát 4 maãu caáy cho kích thích phaùt sinh phoâi soma, toát hôn phaân laäp töø ñænh choài, ñaëc bieät laø thu ñöôïc soá löôïng lôùn caùc phoâi somaDo ñoù, laù maàm cuûa phoâi soma sô caáp laø muïc tieâu tuyeät vôøi cho thí nghieäm chuyeån gen vì noù khoâng nhöõng coù khaû naêng sinh phoâi soma cao maø coøn cho löôïng lôùn phoâi oma treân moät maãu caáy.4. KẾT LUẬNSau 10 ngaøy, moâ seïo coù khaû naêng sinh phoâi phaân chia phaùt trieån thaønh phoâi ôû giai ñoaïn hình caàu. Töø ngaøy 14 cho ñeán ngaøy 21 cuûa quaù trình uû, phoâi soma ôû giai ñoaïn thuaàn thuïc coù hình caù ñuoái vaø 2 laù maàm.Soá löôïng phoâi soma treân moãi maãu caáy thu ñöôïc töø choài ñænh caây in vitro tröôûng thaønh gaàn nhö khoâng khaùc gì so vôùi thu ñöôïc töø caùc choài moïc töø caønh nhaân gioáng nhöng thao taùc laâu ngaøy coù theå laøm saûn sinh ñoät bieán do caùc hoaït ñoäng cuûa gen nhaûy. Vì vaäy, söû duïng ñænh choài phaân laäp töø caùc choài moïc treân caønh nhaân gioáng laø nguoàn thích hôïp cho maãu caáy cho kích thích sinh phoâi soma.4. KẾT LUẬNNoàng ñoä picloram khoâng aûnh höôûng maïnh leân taàn soá phaùt sinh phoâi soma vaø soá löôïng phoâi treân moãi maãu caáy.Söï kích thích phaùt sinh phoâi soma duø phaân laäp töø ñænh choài hay töø caùc maûnh cuûa laù maàm phoâi soma sô caáp ñeàu khoâng coù söï khaùc bieät lôùn. Laù maàm cuûa phoâi soma sô caáp laø muïc tieâu tuyeät vôøi cho thí nghieäm chuyeån gen vì noù khoâng nhöõng coù khaû naêng sinh phoâi soma cao maø coøn cho löôïng lôùn phoâi Soma treân moät maãu caáy.