Những kỹ thuật dựa trên cơ sở protein isozymes

Những kỹ thuật dựa trên cơ sở proteinISOZYMESNội dungGiới thiệu về isozymesThăm dò isozymesCác thiết bị dùng cho nghiên cứuHình ảnh quá trình thực hiệnPhân tích kết quảNhững thuận lợi và bất lợi của phương phápMột số ví dụ áp dụng phương pháp này lên một số đối tượng cụ thểGiới thiệuThuật ngữ ‘isozyme’ đầu tiên được định nghĩa bởi Markert và Moller năm 1959.Trong nghiên cứu di truyền quần thể, isozymes đã được ứng dụng từ năm 1966 trong nghiên cứu Drosophilla và chỉ một vài năm sau cũng đã ứng dụng đối với thực vật bậc cao. Từ đó chúng đã trở thành những chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở cả động vật và thực vật.Giới thiệuIsozymes (isoenzymes) là những dạng phân tử khác nhau về mặt cấu trúc của một hệ enzyme với cùng một chức năng xúc tác. Chúng được xem như là những biến dạng đặc trưng loài của một hệ thống enzyme theo sự phân loại của ‘Enzyme Commision’. Isozyme được tạo ra từ sự biến đổi các amino acid để tạo ra những thay đổi bên trong cấu trúc không gian (conformation) của những phân tử enzyme và vì thế mà dẫn đến sự khác nhau trong chuyển động các phân tử. Multiple forms of enzymesGroupReason of multiplicityExample1Genetically independent proteinsbMalate dehydrogenase in mitochondria and cytosol2Heteropolymers (hybrids) of two or more polypeptide drogenase chains, noncovalently boundbHybrid forms of lactate dehydrogenases3Genetic variants (allelozymes)b Glucose-6-phosphate dehydrogenases in man4Conjugated or derived proteinsa. Proteins conjugated with other groupsPhosphorylase b, glycogen synthase ab. Proteins derived from single polypeptide chainsThe family of chymotrypsins arising from chymotrypsinogen5Polymers of a single subunitGlutamate dehydrogenase of molecular weight 1,000,000 and 250,0006Conformationally different formsAll allosteric modifications of enzymesGiới thiệuViệc kiểm định bằng phép điện di (electrophoresis) sự biển đổi các amino acid như thế cung cấp một phương tiện để quản lý sự thay đổi bên trong trình tự nucleotide của gen liên quan. Vì thế isozymes có thể đánh dấu những biến động allele tại các vị trí cấu trúc gen đơn giản, như vậy các allele khác nhau được biểu hiện bằng những isozymes với động thái điện di khác nhau. Những isozymes được quy định bởi những allele khác nhau của cùng một vị trí trên gen là được thiết kế như ‘allozymes’ hoặc ‘alloenzymes’.Isozyme có nhiều ưu điểm quan trọng như những chỉ thị di truyền (allozymes)đặc trưng của chất nền của những hệ thống enzyme cung cấp cơ sở cho việc kiểm tra những biến động di truyền ở những vị trí gen cấu trúc đặc biệt; allozymes thường được biểu lộ cùng ưu thế (codominantly) vì vậy mà những kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử có thể phân biệt một cách chính xác; zymograms thường có thể được dịch mã bằng sự dịch mã di truyền đơn giản; những hiệu quả lấn át gen là hiếm; phân tích isozyme là dễ thực hiện và nhiều mô thực vật và động vật có thể ứng dụng được; kỹ thuật cho phép kiểm tra quần thể nhanh và suy luận kết quả là dễ dàng do số liệu tham khảo nhiều. Giới thiệuAllozymes có chức năng tốt như những chỉ thị di truyền chuyên biệt cho loài trong xác định khả năng dị hợp, đa dạng di truyền, sự biệt hoá di truyền và nhưng phép đo khác để định lượng những biến động di truyền bên trong và giữa các quần thể. Thêm vào đó, allozymes có thể có ích trong việc xác định các dòng, phân tích nguồn gốc bố, đặc trưng của những nguyên liêu và quần thể đa dạng, những đặc điểm nổi bật của sự sinh sản (ví dụ như giao phối giữa những cá thể có quan hệ gần gũi) và hệ quả di truyền thuần hoá hoặc tác động môi trường lên quần thể. Một số hạn chếnhững gen mã hoá những enzymes biểu hiện một ví dụ không ngẫu nhiên (và nhỏ) của những vị trí cấu trúc gen (có sự loại trừ những enzymes không hoà tan trong nước và giới hạn cấu trúc tế bào); chỉ những sự thay thế nucleotide mà làm thay đổi chuyển động electrophoretic của phân tử enzymes là hiển nhiênkhả năng không thể được loại trừ đó là một hoặc cùng band isozyme biểu hiện trong 2 allele khác nhau với sự chuyển động y hệt nhaucâu hỏi như có phải sự đồng dạng của allozyme là sự thích nghi hay trung tính vẫn còn chưa được giải thích.Phương pháp thăm dò isozymesNhiều phương pháp điện di có thể được áp dụng để phân tích isozymes. Điện di phương ngang là kỹ thuật này là thường được sử dụng trong khảo sát quần thể và dễ thực hiện. Hai môi trường gel được sử dụng là: polyacrylamide và tinh bột thuỷ phân (hydrolysed starch). Polyacrylamide có độ phân giải cao nhưng là độc tố thần kinh Tinh bột là một sản phẩm tự nhiên không độc. Nó kém trong suốt hơn polyacrylamide, nhưng gel của nó có thể cắt lớp mỏng do vậy mà khuôn mẫu có thể nhuộm để kiểm tra một vài hệ enzymes đồng thời. Chiết rút thô có thể trực tiếp đưa vào gel bằng cách dùng giấy lọc. Trong thực nghiệm, tinh bột chất lượng cao (như loại Toronto starch) là đúng tiêu chuẩn đòi hỏi trong sự phân giải điện di trong hầu hết các trường hợp. Phương pháp thăm dò isozymes Điện di trên gelĐiện di là một kỹ thuật sắc ký để tách hỗn hợp của các hợp chất ionĐiện di trên gel là quá trình kết nối giữa việc phân tách các phân tử theo trọng lượng và theo kích cỡ nhờ vào dòng điệnDòng điện làm cho các phân tử di chuyển qua các lỗ trong lớp gelNhững chất để làm gel phải là những chất đặc biệt để có những lỗ có kích cỡ phù hợp cho phép tách thành những lớp riêng theo kích cỡ và hình dạng Phương pháp thăm dò isozymesCác bước tiến hànhXử lý nguyên liệuĐiện di gel tinh bột hay acrylamideNhuộm mô hoá họcPhân tích kết quả điện diXử lý nguyên liệuNguyên liệu thực vật hay động vật: nhiều loại mô có thể được sử dụng để điện di gel. Ở thực vật bậc cao, chồi, đầu rễ, hạt, hạt phấn và những nguyên liệu in vitro là dễ làm đồng nhất và sản lượng cho một nồng độ enzyme cao trong chiết rút thô. Những nguyên liệu khác như mô ở tầng phát sinh gỗ, lá hay gai có thể đòi hỏi một qui trình dung giải đặc biệt Nhiều loại mô côn trùng và động vật rất thích hợp cho phân tích isozyme.Xử lý nguyên liệuLàm nát mẫu vật một cách cơ học bằng chày nghiền để đạt đến một độ đồng nhất nhất định hay nghiền bằng tayHút dịch chiết thô ra một cách đồng thời dùng một vài dải giấy lọc 3MM (rộng 2-4mm). Mỗi dải giấy lọc sẽ được đặt vào một miếng gel khác nhau. Để lấy đi dịch chiết thừa, làm khô dải giấy bằng giấy thấm, tránh nhiễmĐể đưa mẫu vào gel, cắt gel khoảng 2 cm song song với cực âm. Dọc theo chỗ cắt này có thể đưa vào đến 40 dải.Kết thúc quá trình loading mẫu vào gel, ấn đầu gel chặt lại như vị trí ban đầu của nóXử lý nguyên liệuĐệm chiết rút:0.05-0.1 M Tris-HCl (pH 7.0-7.5)Với 2-3% (w/v) polyvinylpyrrolidone hoà tan (PVP 40)Và 0.05% (v/v) β-mercaptoetanolNgoài ra có thể tham khảo thêm các loại đệm khác cho phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu cụ thểChuẩn bị gelThành phần của gel:11% (10-12%) tinh bột2-3% saccharose (hoặc 6-8M urea trong trường hợp đệm Tris-citric)Đệm gel (thể tích dùng tương ứng với số mẫu)Chuẩn bị gelĐun nóng 2/3 đệm gel trong microwave trong 2-3 phútRãi tinh bột và saccharose hay urea vào 1/3 đệm gel còn lại và khuấy cho tanĐổ 2/3 dịch đã làm nóng vào và đun nóng tiếp hỗn hợp trong 2-3’Rót hỗn hợp lên đĩa thuỷ tinh bên trong khuôn gelLàm lạnh khoảng 20 min bằng cách chuyển vào tủ lạnh ở 4°CĐiện di trên gelĐể tiến hành quá trình điện di, làm đầy bể điện di bằng đệm và phủ lên bề mặt gel Gắn dòng điện vào hệ thốngĐể chạy trong một vài giờNhuộmSau khi quá trình điện di hoàn tất, cắt lớp gel tinh bột theo cùng chiều và chuyển các lớp cắt đó một cách cẩn thận vào những khay nhuộm riêngNhuộm gels bằng dung dịch nhuộm, đối với mỗi loại enzymes sẽ có một loại dịch nhuộm riêng, công việc này được tiến hành đồng thờiPhân tích phổ enzyme Dung dịch nhuộmDung dịch nhuộm cho các hệ enzyme chọn lọc:Stock solutions: 10% MgCl2; 1mg PMS/1ml H2O; NAD,NADP: 2m/ml H2OĐệm nhuộm: 0.08 M Tris-0.04 M HCl (pH 8.0)Các hình ảnh của các bước tiến hành Sau đây là hình ảnh minh hoạ các bước tiến hành thăm dò isozymesKỹ thuật viên đang cho đệm chiết rút lên các phần cắt của lá. Mỗi mẫu đặt trong một đĩa plastic. Mảnh lá rồi được nghiền nát với một que plastic để chắc rằng các mảnh lá vỡ ra và hoà vào đệm.Điều này phải được làm càn nhanh càng tốt để tránh gia tăng nhiệt độ. Do vậy mà trong khi nghiền thì có thể đặt các đĩa đựng ở trên đá. Những sợi giấy nhỏ sẽ được đặt vào trong dịch chiết cho đến khi giấy hấp thụ hết mẫuDung dịch tinh bột đã được làm nóng là được rót vào khuôn gel. Khi gel được làm nguội, chúng có dạng jelly. Rồi chúng sẽ được dùng để load mẫu vào.Trước khi dùng, gel có thể được giữ trong tủ lạnhGel tinh bột được cắt bằng dao mổ ở khoảng 1/3 khuôn gel. Những dải giấy thấm rồi được đặt theo hướng thẳng đứng theo hướng cắt dùng cái nhíp.Máy hổ trợ nguồn được sử dụng để điều khiển điện áp và cường độ dòng điện.Gel được đặt vào bể điện di bên trong buồng lạnh hoặc trong tủ lạnh. Bể điện di có chứa đệm ở hai đầu điện cực và việc nối giữa đệm và gel được thực hiện với một miếng xốp hay một mảnh vải. Giấy nhựa mỏng được đậy lên bề mặt để tránh bị làm khô trong suốt quá trình. Mẫu được load và điều này được thấy bằng mắt thường nhờ màu xanh.Khi quá trình chạy hoàn tất (thường khi những vết màu hơi nâu được thấy ở đầu kia của gel loading), gel cần được cắt thành những lớp. Gel được đặt vào vào tấm kínhMột tấm kính được đăt trên gel có thể được dùng để giữ tấm gel trong khi cắt để đảm bảo những slices là bằng nhau. Một cái cưa tay được làm bằng sợi dây đàn dược sử dụng để cắt gel thành những slicesNhững dung dịch nhuộm khác nhau sẽ cho chúng ta thấy được những enzymes khác nhau. ở đây, dung dịch nhuộm màu vàn đang được rót vào một bể chứa trước khi các miếng gel được chuyển vàoMột lớp gel đang được chuyển vào trong bể nhuộm với dung dịch nhuộm mong muốn. Cẩn thận khi chuyển vì gel dễ gãy. Nếu bị gẫy sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả đọc.Sau một thời gian ủ, một tấm gel đã được nhuộm sẽ có hình tương tự như trên Giải thích (dịch mã) mẫu hình của các bandNhững vấn đề chính là:Cấu trúc bậc 4 của enzymes (kể cả monomeric, dimeric)Cây nghiên cứu là đồng hợp tử hay dị hợp tử ở tại mỗi locus của geneSố loci của geneSố allele trên một locusCó bao nhiêu gene được di truyền lại?Giải thích (dịch mã) mẫu hình của các bandsAllozymes được điều khiển bởi những allele đồng trội có nghĩa là đồng hợp tử, có thể được phân biệt với dị hợp tửĐối với các enzyme monomeric (bao gồm 1 polypeptide đơn), những cây đồng hợp tử đối với 1 locus sẽ cho 1 band, trong khi cá thể dị hợp tử sẽ tạo ra 2 bands.Đối với các enzyme dimeric (bao gồm 2 polypeptide), cây đồng hợp tử đối với 1 locus sẽ cho ra 1 band, trong khi cây dị hợp sẽ cho 3 bands do sự liên kết ngẫu nhiên giữa các polypeptides.Những enzymes multimeric cũng tồn tại, nơi mà những polypeptides được đặc trưng bởi những loci khác nhau. Những thông tin về cấu trúc enzyme (isozymic heteromers) có thể làm phức tạp thêm mẫu hình của các band.Những sự phức tạp này và tầm quan trọng của việc dịch đúng mẫu hình các bands càng làm cho việc phân tích di truyền có kết quả đúng như mong đợi.This example shows the behaviour of monomeric enzymes in crosses. Parents arehomozygous for the same allele at the same locus or heterozygotes. In the first case,all F1 progeny will be homozygous and, as a consequence, a single band will result. Ifparents are heterozygous, three possible F1 phenotypes will result.In crosses, dimeric enzymes may behave in three possible ways. If both parents are homozygous for different alleles at the same locus, all progeny are heterozygous, but because of random association of the polypeptides, three combinations are possible and therefore three bands will be resolved on gel electrophoresis and staining.Trong ví dụ này, allozyme dimeric 2 gene với 2 alleles, 2 polypeptides của enzyme được code ở 2 locus khác nhau. Bố me không share bất kỳ allele nào. Sự kết hợp ngẫu nhiên giữa các polypeptide dẫn đến một tổng số của 10 dimers, bởi vì cả hai dimers bên trong gene(allele tại cùng một locus) và dimer liên kết gene (allele từ những loci khác nhau) là cùng được hình thành.Trong ví dụ trên, một tetraploid dị hợp, với 4 alleles trên một locus, hình thành nên 10 enzymes dimeric.Những thuận tiện và bất tiện của phương pháp nàyThuận tiện:Là phương pháp thô và có thể lặp lại đượcĐồng trội nên thích hợp cho việc đánh giá trên một khoảng rộng để đo di truyền quần thể và cho việc lập bản đồ geneCó khoảng 90 enzymes được dùng đối với thực vật với vị trí isozymes được lập bản đồ trong nhiều trường hợpBất tiện:Có tương đối ít các phép phân tích là có sẵn để thăm dò enzymes. Giới hạn chính của phân tích isozymes là có ít marker được cung cấp vì số lượng phép phân tích sinh hoá có sẵn để thăm dò chúng là quá nhỏ. Kết quả là tỉ lệ phần trăm những thông tin đưa ra là không đủ cho những nghiên cứu đa dạng di truyềnPhân tích dựa vào kiểu hình. Vì vậy có thể bị ảnh hưởng bới điều kiện môi trường do đó sẽ có những biểu hiện làm sai lệch kết quả. Bởi vì những biểu hiện khác nhau của gene có thể xảy ra ở những giai đoạn phát triển khác nhau, hoặc trong những mô khác nhau, cùng một nguyên liệu phải được dùng cho tất cả các thí nghiệm.Tóm lạiKỹ thuật isozyme là dựa vào sự chiết rút protein, tách bằng điện di trên gel và nhuộm mô hoá học.Phương tiện cần thiết là đơn giảnSự dịch mã các mẫu hình gel điện di về cơ bản là sự đồng trội, và bởi vì sự phức tạp của nó có thể đòi hỏi sự phân tích di truyềnIsozymes khi là chỉ thị di truyền là có tính lặp lại caoNhững điều cần nhớCác bước chính liên quan đến kỹ thuật isozymeNhững điểm chính liên quan đến việc dịch mã (giải thích) mẫu hình các dải (band) điện diNhững ưu điểm và nhược điểm của phương pháp này (như một marker di truyền) là gì?