Bài giảng Chương 5: Nghiên cứu protein/enzim

CHƯƠNG 5Nghiên cứu protein/enzimContentsWhy are proteins/enzymes studied ?How to research proteins/enzyme ?.Application of purified protein/enzymes.1. INTRODUCTIONCaenorhabditis elegans: 19.000 gene mã hóa proteinDrosphilia melanogaster: 14.000 gene mã hóa proteinHomo sapiens: 14.000 gene mã hóa proteinProteomics là ngành học hậu genome nghiên cứu các protein sau tổng hợp.2. How to research proteins/enzymesTrình tự aa PURIFICATION BY DIFFERENT METHODS4. AFFINITY CHROMATOGRAPHY2. ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY3. GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY1. AMMONIUM SULPHATEPURIFIED PROTEINHÀM LƯỢNG PROTEIN5. PP BRADFORF (1976)2. PP QUANG PHỔ4. PP LOWRY (1951)1. PP KJELDAHL (1883)3. PP BIURET (1949)6. PP BCA (1985)ĐIỆN DI1. SDS-PAGE (..)2. ISO ELECTROPHORESIS ()HOẠT TÍNH ENZIM1. PP KUNITZ CẢI TIẾN (PROTEASE)2. PP NELSON (Amylase, cellulase)Động học enzim	ANIMAL TISSUEPLANT TISSUETẾ BÀO VSV2.1 AMMONIUM SULPHATE*	Nguyên tắc: Tính tan của protein.*	Ex.Huyết thanh 	+ 0.8M A.S	fibrinogen 	 Huyết thanh + 2.4M A.S	Albumin huyết thanh(serum albumin)	Thẩm tích	Thẩm tíchThẩm tích tách muối2.2 ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY*	Principle:Điện tích bề mặt phân tử protein.2.3 GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY*	Principle:Kích thước proteinTính ái lực đặc hiệu2.4 AFFINITY CHROMATOGRAPHY*	Principle:Phổ sắc kýODAb A 280nmPhân đoạn protein2. How to research proteins/enzyme (20.9)Trình tự aa PURIFICATION BY DIFFERENT METHODS4. AFFINITY CHROMATOGRAPHY2. ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY3. GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY1. AMMONIUM SULPHATEPURIFIED PROTEINHÀM LƯỢNG PROTEIN5. PP BRADFORF (1976)2. PP QUANG PHỔ4. PP LOWRY (1951)1. PP KJELDAHL (1883)3. PP BIURET (1949)6. PP BCA (1985)ĐIỆN DI1. SDS-PAGE (..)2. ISO ELECTROPHORESIS ()HOẠT TÍNH ENZIM1. PP KUNITZ CẢI TIẾN (PROTEASE)2. PP NELSON (Amylase, cellulase)Động học enzim	ANIMAL TISSUEPLANT TISSUETẾ BÀO VSV3.1 PP KJELDAHL (1883)Nhà hóa học người Đan mạch Johan G.C.T. Kjeldahl (1883).Mục đích: Xác định hàm lượng nitơ tổng (20-100 mg). Nguyên tắc: Vô cơ hóa mẫu bằng sulfuric acid và định lượng	 ammoniac sinh ra. * Xử lý mẫu với hỗn hợp (chất xúc tác và sulfuric acid), đun ở nhiệt độ cao trong một giờ, Đưa về pH kiếm với sodium hydroxide * Làm bốc hơi amoniac từ hỗn hợp, dẫn hơi amoniac vào dung dịch có chứa boric acid như là chất chỉ thị, chuẩn độ mẫu bằng acid hydrochloric hay sulfuric acidQui trình:3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN3.2 PP. QUANG PHỔĐo phổ hấp thụ (OD) cực đại ở bước sóng 275 - 280 nm. Nguyên tắc: Một số các acid amin hấp thụ ánh sáng tia cực tím	 (UV): Tryptophan, tyrosine và phenylalanine .Nồng độ protein tối đa có thể xác định 4 mg/ml.Không nhạy bằng các phương pháp đo phổ hấp thụ của các hợp chất màu. Bị nhiễu bởi các tạp chất khác: ADN.3.3 PP. BIURET (1949)*	PP lầu đời nhất, được A.G. Gornall đưa ra đầu tiên năm 1949.*	Dùng để xác định protein trong mẫu có hàm lượng protein cao (khỏang: 1-5 mg protein/ml) Ion Cu2+-sulfate môi trường kiềm Sodium tartrate phản ứng với các protein cho ra sản phẫm phức hợp màu tím (phức hợp copper-protein) có phổ hấp thụ cưc đại ở 540 nm. Phản ứng gồm hai bước: 1. Tạo phức với ion Cu2+ trong môi trường kiềmCu2+/OH- + protein —> [Cu2+-protein complex]2. Phản ứng oxy hóa - khửCu2+ + (các acid amin phân cực, Trp, Tyr)—> Cu+ (amino acids)*	Độ nhạy không cao (100 to 1000 lần thấp hơn LOWRY, BCA or BRADFORD)*	Principle:3.4 PP. LOWRY (1951)*	Do O.H. LOWRY đề ra (Lowry, O.H.; Rosebrough, N.J.; Farr, A.L.; Randall, R.J.; J. 	Biol. Chem. 1951, 193, 265-275. Protein measurement with the Folin phenol reagent).*	Độ nhạy cao: cho phép xác định từ 10 - 200 µg of protein, bước sóng hấp thụ trong khỏang : 500 - 750 nm (các protein có nhóm hemes, flavins phản ứng rất nhạy). Nồng độ protein được xác định với hợp chất màu phenol Folin-Ciocalteu, phản ứng kép tạo phức đồng. Phản ứng gồm hai bước: Cu2+ tạo phức với các liên kết peptide trong protein ở pH kiềm. Phức hợp protein-Cu2+ sẽ phản ứng với dung dịch Folin-phenol: (Na2MoO4 + Na2WoO4 + H3PO4 trong phenol) tạo phức hợp có màu xanh dương đậm hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 750nm _ Các acid mạnh và muối ammonium sulphat ảnh hưởng lên phản ứng.Phản ứng nhạy với các tạp chất màu khác Độ hấp thụ không tăng tuyến tính theo nồng độThành phần acid amin ảnh hưởng đến sự phát triển màu trong phản ứng LOWRY[để dựng đường chuẩn nên dùng các protein có cấu trúc tương tự để có kết quả chính xác.Những biến đổi của hóa chất, nhiệt độ, và thời gian đòi hỏi phải dựng đường chuẩn mỗi lần tiến hành xác định hàm lượng*	Principle:3.5 PP. PP BRADFORF (1976)*	Bradford, M.M.; Anal. Biochem. 1976Phương pháp dựa trên sự biến đổi độ hấp thụ ánh sáng của Coomassie Brilliant Blue Bước sóng hấp thụ cực đại dịch chuyển từ 465 nm sang 595 nm, khi chất màu trong liên kết với protein. Protein ổn định mang diện tích âm trong liên kết với chất màu bằng tương tác kỵ nước và ion (tương tác chủ yếu dực trên các gốc arginin, và ở mức độ thấp hơn là histidine, lysine, tyrosine, tryptophan và phenlyalanine *	Principle:*	BRADFORD reagent = Coomassie 	Brilliant Blue G-250*	Thuận lợi	Độ nhạy cao (xác định protein trong khỏang 1-20 ug/ml) 	phương pháp đơn giản, nhanh, dễ thực hiện và không bị ảnh 	hưởng bởi các chất khử như trong phương pháp LOWRY và 	BCA*	Bất lợi	các protein khác nhau tạo phức hấp thụ khác nhau , vì vậy 	cần chọn lọai protein có cấu trúc tương đồng với protein cần 	xác định hàm lượng. 3.5 PP. PP BRADFORF (1976)3.6 PP. BCA (1985)*	Smith, P.K.; Krohn, R.I.; Hermanson, G.T.; Mallia, A.K.; Gartner, F.H.; Provenzano, M.D.; Fujimoto, E.K.; Goeke, N.M.; Olson, B.J.; Klenk, D.C.; Anal. Biochem. 1985, 150(1), 76-85. Measurement of protein using bicinchoninic acid. [PubMed] *	BCA = 2,2'-Bicinchoninic Acid or 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline.Cu2+ bị khử bởi các liên kết peptide cho ra Cu+.2 phân tử BCA sẽ tạo phức Bicinchoninic acid với Cu+, phức màu tím, hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 562nm *	Principle:HOẠT TÍNH ENZIM4.1 HOẠT TÍNH PROEASE*	PP. Kunitz cải tiến*	Principle:	Protease thủy phân casein tạo sản phẩm thủy phân, một số phân tửcó thể là những chuỗi polypetide ngắn, amino acid với đầu tận cùng là một trong ba amino acid: ..	Hoạt tính được xác định dựa vào khả năng hấp thụ tia cực tím (UV) của sản phẩm thủy phân ở bước sóng 280 nm.4.1 HOẠT TÍNH AMYLASE*	PP. Nelson Somogyi*	Principle:Amylase thủy phân tinh bột cho ra các đường khử. Hoạt tính enzyme được xác định dựa vào lượng đường khử sinh ra thông qua phản ứng trung gian với thuốc thử Nelson Somogyi.4.3 HOẠT TÍNH LYSOZIM*	PP. do *	Principle:	PP dựa trên những thay đổi độ đục trong dung dịch vi khuần Micrococcus lysodeikticus (G+). Đo quang phổ về sự phá huỷ vách tế bào ở 450nm. 	Khi lysozyme hoạt động, vách tế bào vi khuẩn bị phân huỷ làm cho độ hấp thu của dịch huyền phù này giảm đi.4.3 Bảng đánh giá qui trình tinh sạchELECTROPHORESIS5.1 SDS - PAGE*	Tác giả: Kích thước*	Principle: Điện tích*	Sơ đồ đánh giá chất lượngqui trình tinh sạchCác băng protein trên gel polyacrylamid (nhuộm màu với coomasie blue) Biểu đồ đường chuẩn protein5.1 SDS - PAGE5.2 Isoelectric focusing electrophoresis5.2 Điện di điểm đẳng điện (Isoelectric focusing electrphoresis)5.2 Điện di điểm đẳng điện (Isoelectric focusing electrophoresis)6. Đánh giá kế quả thủy phânHết phần tinh sạch protein