Bài giảng môn Sinh học - Kiểm soát dừng phản ứng tổng hợp arnm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2PHÒNG SAU ĐẠI HỌCBÀI TẬP CHUYÊN ĐỀ SINH HỌC PHÂN TỬHỌC VIÊN: DƯƠNG VĂN PHONG K12 SHTNKIỂM SOÁT DỪNG PHẢN ỨNG TỔNG HỢP ARNm GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. ĐÀO XUÂN TÂNKIỂM SOÁT DỪNG PHẢN ỨNG TỔNG HỢP ARNmDiễn biến quá trình phiên mã( gồm 3 giai đoạn)	Giai đoạn khởi động: ARN polymerase gắn vào promoter ở vị trí -35 trượt dọc theo gen đến trình tự-10; Phân tử ADN bắt đầu tháo xoắn, sợi đơn làm khuông tách ra; Quá trình phiên mã tổng hợp mARN bắt đầu và di chuyển dọc theo sợi ADN đã được tháo xoắn.	Giai đoạn kéo dài: Các nucleotit được lắp ráp (A-U, G-C) thành mạch ARN kéo dài theo hướng 5’-3’	Giai đoạn kết thúc: ARN polymerase gặp tín hiệu kết thúc phiên mã thì dừng lại. Phân tử ARN được tổng hợp tách khỏi mạch khuôn. ARN polymerase cũng được tách khỏi ADN.( Hình 1) Hình 1. Các giai đoạn của quá trình phiên mãTrong nội dung này chúng ta đi sâu vào các cơ chế kiểm soát dừng phản ứng tổng hợp ARNm. Có hai cách kết thúc là tạo thành cấu trúc kẹp tóc và nhờ nhân tố Rho độc lập.I. PHẢN ỨNG DỪNG TỔNG HỢP ARNm DO HÌNH THÀNH CẤU TRÚC ĐẶC BIỆT “HAIRPIN”	Trong thí nghiệm tổng hợp ARNm invitro, enzyme ARN polymerase luôn dừng lại tại những đoạn ARN có chuỗi nucleotit lặp lại ngược chiều (inverted repeat) giàu G và C (thời gian dừng khoảng 60 giây). Các chuỗi lặp lại ngược chiều liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung tạo cấu trúc “hairpin” gọi là kẹp tóc (Hình 2)Hình 2. Kết thúc phản ứng tổng hợp ARNm nhờ cấu trúc đặc biệt “hairpin”. Cấu trúc này tạo ra do liên kết giữa các chuỗi nucleotit lặp lại ngược chiều “inverted repeat” và được nối tiếp bởi chuỗi base U. Enzym ARN polymerase bị dừng lại và rời khỏi vị trí đặc hiệu này. Phân tử ARNm được tổng hợp hoàn chỉnh.	Cấu trúc này làm cho ARN polymerase dừng hoặc chuyển động chậm. Tuy nhiên để làm enzyme tách ra khỏi khuôn ADN, tiếp theo cấu trúc kẹp tóc cần có các nucleotit U nối nhau liên tiếp. Liên kết A-U giữa ARN và ADN là các liên kết yếu nên cần ít năng lượng để bẻ gẫy chúng.Thực nghiệm cho thấy khi một đột biến xảy ra ở đoạn nucleotit U tiếp sau cấu trúc kẹp tóc thì ARN polymerase vẫn tiếp tục tổng hợp ARNm. Do đó vị trí kết thúc quá trình phiên mã phụ thuộc vào 2 yếu tố:	Cấu trúc kẹp tóc của các đoạn “inverted repeat” giàu G, C trên phân tử ARNm làm enzyme ARN polymerase dừng chuyển động.	Đoạn ngắn nucleotit gồm các base U tiếp ngay sau cấu trúc kẹp tóc khiến enzym tách rời khuôn và phân tử ARNm được tổng hợp hoàn chỉnh.II. PHẢN ỨNG DỪNG TỔNG HỢP ARNm BỞI PRÔTÊIN ĐẶC BIỆT RHO	Trong khi ARN polymerase có thể tự kết thúc ở cấu trúc kẹp tóc bằng các đoạn base, nhưng các thành phần khác không thể tạo một cấu trúc kẹp tóc vững chắc. Chúng sử dụng một yếu tố khác, đó là protein Rho để giúp kết thúc phiên mã. 	Rho là một hexameric protein mà thủy phân ATP có mặt trong sợi đơn ARN. Protein xuất hiện để liên kết với một đoạn 72 nucleotit trong ARN, có thể thông qua sự nhận ra bởi một cấu trúc đặc biệt hơn là hình đó, có khả năng là ARN polymerase kết thúc ở nhân tố kết thúc phiên mã Rho. Như nhân tố kết thúc độc lập rho, những tín hiệu này được nhận ra trong chuỗi ARN mới dược tổng hợp hơn là trong chuỗi khuôn ADN. Với đơn vị kết thúc này, ADN vẫn chứa trình tự lặp lại đảo ngược nhưng không chứa dãy adenin (bổ sung với dãy uraxin trong ARN) có thể dãy adenin và vùng liên kết yếu giữa ADN và ARN không cần thiết khi mà protein rho chịu trách nhiệm giải phóng. Cần chú ý là Rho không két hợp với ARN polymerase và hai enzyme này làm việc độc lập.Hình 3. Cơ chế hoạt động của protein Rho làm ngừng phản ứng tổng hợp ARNm tại vị trí chính xác được nhận biết bởi protein này.	Trong phản ứng tổng hợp ARNm invitro nếu không có dịch tách chiết từ tế bào thì thường nhận được các phân tử ARNm có kích thước khác nhau do enzyme ARN polymerase không dừng đúng chỗ. Khi dịch tách chiết được thêm vào môi trường thí nghiệm, enzyme kết thúc chính xác phản ứng, cho các phân tử ARNm có chiều dài duy nhất. Protein chịu trách nhiệm dừng phản ứng tại vị trí đặc hiệu có hoạt tính ATPase và được gọi là protein Rho.Protein ngăn cản dừng tổng hợp ARNm 	Protein Rho bị mất hoạt tính bởi sự có mặt của protein N. Đây là protein đặc hiệu ngăn cản việc dừng phản ứng tổng hợp ARNm, giúp cho ARN polymerase vượt qua các vị trí dừng. Tác dụng của protein N được phát hiện và nghiên cứu kỹ đối với phản ứng tổng hợp các ARNm của bacteriophage khi chúng xâm nhập vào tế bào vật chủ E. côli.	Sản phẩm phiên mã thường dài hơn gen quy định của nó. Do sự phiên mã phần promoter ở phía 5’ nằm trước gen, tạo đoạn đầu trên ARN. Chiều dài của đoạn đầu rất khác nhau, có thể gắn với vài nucleotit hoặc dài tới vài trăm nucleotit. Còn phần kết thúc là hướng về phía đầu 3’ của gen, nằm sau gen nên ARN có thêm phần cuối.	Khi xâm nhập vào tế bào vi khuẩn E. Coli, genome của bacteriophage ở dạng vòng. Quá trình tổng hợp ARNm được bắt đầu ở hai promoter trái PL và phải PR và tiếp tục xa dần sang hai phía. Tuy nhiên trong giai đoạn đầu tiên bắt đầu xâm nhập, các phân tử ARNm được tổng hợp có kích thước rất ngắn (khoảng 1000 base tính từ PL, khoảng 500 base tính từ PR) do ARN polymerase dừng lại ở hai vị trí PL và PR. Phân tử ARNm sao chép từ PL mã cho protein N có tác dụng ngăn cản việc dừng tổng hợp ở hai vị trí này. Nhờ đó các phân tử ARNm được tổng hợp dài hơn tương ứng với các gen khác nhau của genome (Hình 4)PLNPRCroTLTRVị trí nutPLNPRCroTLTRARNm(~1000 nt)ARNm(~500nt)Protein NGiúp ARN polymerase vượt qua các vị trí dừng TL và TRProtein CroARNmARNmHình 4. Tác dụng của protein N giúp ARN polymerase vượt qua các vị trí dừng trong phản ứng tổng hợp ARNm khi thực khuẩn thể phage xâm nhiễm tế bào chủ. Hai vị trí dừng TL và TR được nhận biết bởi protein Rho. Do tác dụng của N, protein Rho bị mất hoạt tính, nhờ đó enzyme vượt qua hai vị trí này để tổng hợp các phân tử ARNm dài hơn tương ứng với các enzym nằm xa hai promoter PL và PR.Cơ chế hoạt động của protein N được mô tả trên Hình 5:PRTRnutProtein NARNmPRTRnutARNmPRCroTRVị trí nutARN polymerasePRTRNusAnutARNmHình 5. Cơ chế hoạt động của protein N tại vị trí TR ngăn cản việc ngừng tổng hợp ARNm trên genome của bacteriophage .	Protein N tương tác với protein NusA. Khi enzym ARN polymerase đã bắt đầu tổng hợp ARNm, phần tử sigma tách ra khỏi enzym, phần còn lại sẽ liên kết với protein NusA. Khi enzym chuyển động đến vị trí đặc hiệu nut trên khuôn ADN, protein NusA sẽ tương tác với protein N. Vị trí này thường nằm gần vị trí nhận biết bởi protein Rho. Ngoài ra còn có các protein khác như NusA, NusB, NusG tương tác với protein NusA và protein N tạo phức hợp giúp enzym vượt qua các vị trí dừng trong phản ứng tổng hợp ARNm.