Bài giảng Sinh học - Bài 3: Một số kỹ thuật phân tích nucleic acid: điện di và đo mật độ quang

MSc. TRUONG LE NABÀI 3Một số kỹ thuật phân tích nucleic acid: ĐIỆN DI và ĐO MẬT ĐỘ QUANG Thực tập Sinh học phân tử Đại cương KIỂM TRA 5’Đề xuất quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Bacillus subtillis từ 2ml dịch nuôi cấy vi khuẩn qua đêm ĐÁP ÁNBacilus subtilis là vi khuẩn gram dương, (gram positive bacteria) có vách tế bào dày (2) Quy trình tách chiết DNA gồm 3 bước Phá vách tế bào: dung dịch 10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, 100 mM, NaCl, 2% SDS, và 400 mg/ml Proteinase K, ủ ở 56°C trong 30 phút. (3/2) Loại protein: dùng Phenol/Chloroform (3) Tủa DNA: dùng Ethanol/Isopropanol tuyệt đối, lạnh (2) NỘI DUNG Điện di xem kết quả DNA TB má người và RNA vi khuẩn E. coli đã tách chiết. Đánh giá độ nguyên vẹn của sản phẩm tách chiếtĐo mật độ quang 2 sản phẩm. Đánh giá nồng độ và độ sạch của sản phẩm thu được 	MỤC TIÊU Nắm được nguyên lý điện di, các yếu tố ảnh hưởng đến điện diNắm được nguyên lý đo mật độ quang. Cách tính nồng độ DNA/RNA.Hiểu được hiệu ứng siêu sắc Điện di (Electrophoresis) Mục tiêu của điện diNguyên lý điện diCác yếu tố ảnh hưởng đến điện di Điện di trên gel agarose Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di Kích thước phân tửKích thước lỗ gelCấu hình phân tử DNANồng độ DNADung dịch điện di: TAE 1X Thời gian điện di Nồng độ agarose Agarose (%)Mức độ phân tách (kb)0.530 -1 0.712-0.8110- 0.51.27-0.41.53-0.2Độ phân tách (Gel acrylamide) Phát hiện DNA/RNA trên gel agarose: EtBrEthidium Bromide (0,25-1 microgram/ml)SYBR GreenThang DNA Dung dich nạp mẫu điện di Loading dye 6X Bromophenol Blue 0.25%Glycerol 40% VĐịnh lượng DNA/RNA: Máy đo quang phổ (Spectrophotometry)DNA/RNA hấp thụ ánh sáng tối ưu ở OD260nm Giá trị hấp thụ là đơn vị OD1 OD = 50ug/ml DNA sợi đôi 1 OD = 40ug/ml RNA/DNA sợi đơnNguyên lý đo mật độ quang Spectrophotometry: NanoDrop Kích thước mẫu nhỏ: 1 – 2 μLKhông cần pha loãng Nhanh, dễ sử dụng Lưu trữ dữ liệu trên máy tính Tự động biến đổi giá trị OD thành lượng NanoDrop (2) Hiệu ứng siêu sắcQuy trình thí nghiệm 50 ul DNA tế bào má10 ul+ 10 ul = 20 ul RNA E.coli25 ul DNA + 50 ul TE1 X20 ul DNA + 4ul dd nạp mẫu 6XĐO 0D260, OD280 Biến tính 100oC, 10 phút Ủ trên đá 10 phút ĐO OD 260ĐIỆN DI20 ul + 4 ul dd nạp mẫuĐIỆN DIHút 5ul DNA Kết quả Phân tích DNA Nhóm 5 NhómOD 260OD 280OD 260/ OD 280 OD 260 sau btNồng độ DNANồng độ DNA ban đầu10,5390,3371,5990,85726,9580,8520.4660.2661.74880.64623.369.931.2850.7341.71411.59062.900188.70040.1910.1171.63441.0279.5528.6552.8671.6871.6932.982143.35430.0560.3750.2101.79020.75018.7556.2570.9230.561.651.20246.15138.4580.7500.4671.60521.27937.5112.5Kết quả Phân tích DNA Nhóm 5NhómOD 260OD 280OD 260/ OD 280 OD 260 sau biến tínhNồng độ DNANồng độ DNA ban đầu10,2270,1451.570.48811.3534.0520.3050.1741.750.63715.2545.7530.6720.4481.51.20033.6100.840.6420.3451.861.08632.196.350,3680,2131,730,79918.455.260.5310.3611.471.03926.5579.6570.7720.4331.781.00436.1108.180.4570.2871.590.94422.8568.55Kết quả điện di DNA Nhóm 51 2 3 4 5 6 7 8 T CKết quả điện di RNAPhân tích kết quả điện di/Đo OD260Kích thước sản phẩmDNA có nguyên vẹn không?Khác biệt DNA/RNA1.8 < OD260/OD280 < 2.0: Đánh giá độ sạch DNA tách chiếtMột số ứng dụng của điện di Xem kết quả tách chiết DNA/RNAXem kết quả sản phẩm PCRPhát hiện đột biến điểm: SSCP Phát hiện đa hình di truyền: RAPD, RFLP SSCP, RAPD, RFLP, PCR Bài tập Sinh viên Đào tách chiết DNA bộ gene từ tế bào động vật nuôi cấy rồi đo mật độ quang để kiểm tra chất lượng DNA thu nhận được. Giá trị mật độ quang của mẫu đã được pha loãng 20 lần ở bước sóng 260 nm là 1,675 và ở 280 nm là 1,290. Để cải thiện chất lượng mẫu tách chiết được, Đào đã tiến hành xử lý thêm mẫu DNA này. Sau khi xử lý, giá trị mật độ quang của mẫu được pha loãng 20 lần ở bước sóng 260 và 280 nm lần lượt là: 1,475 và 0.80Nhận xét chất lượng mẫu DNA ban đầu Đào thu nhận đượcQui trình và hóa chất Đào cần sử dụng để cải thiện chất lượng mẫu.Tính lượng DNA Đào thu nhận được sau khi xử lý thêm