Bài giảng Sinh học - Embryo collection

Embryo CollectionTRÖÔØNG DHDL VAÊN LANGKHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏCLÔÙP K11SGVHD: TS.LEÂ XUAÂN CÖÔNGI. dung dòch gioäi röûa, nuoâi phoâi ngoøai cô theåII. Duïng cuï laáy phoâiIII. Phöông phaùp thu phoâiIV. Soi tìm phoâiV. Nhöõng yeáu toá aûnh höôûng tôùi keát quaû thu phoâiVI. Phaân loïai phoâiI- DUNG DỊCH GiỘI RỮA, Sau khi lấy phôi khỏi cơ thể mẹ, phôi được nuôi bảo quản và cất giữ để chờ cấy chuyển. do đó chất lượng của dung dịch giội rửa, nuôi và bảo quản phôi, ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ đậu thai sau khi cấyChỉ tiêuYêu cầu pH Áp suất thẩm thấu Ẩm độ Nhiệt độ Dung dịch đệm Khử trùng Chất phân tử lớn7,2 – 7,6270 - 310 mOSM/kg100%Nhiệt độ trong phòng từ 15 - 25 oC hoặc 37oC trong tủ ấmCó ion phosphatase hoăc bicarbonateLọc môi trường qua hệ thống màng lọc có kích thước 0,22, vô khuẩn, vô trùng bằng sự bổ sung các chất kháng sinh như penicillineG vá streptomycine sunphateThêm vào môi trường huyết thanh thai bê(FCS) hoặc albumin huyết thanh bò BSA, tất cả đã được khừ trùngCác yêu cầu về môi trườngQui trình pha dung dịch PBS Hòa tan NaCl, KCl, NaHPO4, KH2PO4 trong 8 lít nước cất 2 lần hoặc 3 lần Hòa tan CaCl2, MgCl2 hơặc MgSO4 trong 2 lít nước cất theo thứ tự Khử trùng trong Autoclace ở nhiệt độ 115oC 1atm trong 10-15 phút để nguội đến 30-40oC đổ hỗn hợp 2 lít vào 8 lít Hỗn hợp được thanh trung và bổ sung thêm Na pyruvate, glucose, streptomycin sulphate, Na penicillin. Sau đó đóng gói bảo quản trong buồng lạnh Khi sử dụng giội rửa phải bổ sung thêm 1% huyết thanh thai bê hoặc 1 – 2g BSA/1 lit dung dịch Khi nuôi cấy, đông lạnh và cấy chuyển thì bổ sung thêm 10 – 20% FCS hoặc 4g BSA/1 lit dung dịchThành phần dung dịch PBS trong 10 lít dung dịchThành phầnSố lượng (gram)Vlahov và ctv,1987 HAFEZ, 1987Seidel.E và M. Seidel 1991Norio Saito 1994CaCl2CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OMgCl2.6H2O -1,32-1 -1,321,21- 1,321,21-- 1--1 NaClKClNa2HPO4KH2PO4GlucoseNa pyruvateStreptomycinsunfateNa penicillinG 80211,52100,360,51.000.0 UI 80211,52100,360,51.000.0 UI 80211,52100,360,51.000.0 UI 80211,52100,3611.000.0UIII. DỤNG CỤ LẤY PHÔIFoley catherter 2 đườngFoley catherter 3 đường- Foley catherter 2 đường hoặc 3 đường, kích cỡ tùy thuộc vào phương pháp giội rửa và kích thước tử cung của bò cho phôi.- Lõi thép cho vào bên trong foley catherter (ruột của foley catherter- Lõi thép làm nới rộng lỗ cổ tử cungKhi giội rửa thu hoạch phôi cần có một số dụng cụ sau:- Bình thủy tinh hoặc nhựa (tốt nhất là thủy tinh) để đựng dung dịch giội rửa. Các ống nhựa hình chữ T hoặc chữ Y để nối các ống thông khi giội rửa, có các kẹp hoặc khóa đi cùng giúp cho việc đóng mở để dung dịch vào ra thuận tiện. Các loại ống tiêm loại 5, 20, 50 ml. Kim tiêm loại 18G và các cỡ khác nếu cần. Dung dịch PBS pha sẵn trong túi nilon hoặc trong chai lọ. Các panh để kẹp khi cần thiết. Kim hoặc dụng cụ tiêm vào tử cung khi cần thiết. Găng tay nilon. Mỏ vịt và đèn soi âm đạo, lỗ tử cung khi cần thiết. Cồn sát trùng. Giấy vệ sinh, bông, thừng. Thuốc gây tê 2% Xylocaine. Vadơlin. Dung dịch Lugol khi cần thiết. Các loại hormon FSH, PMSG, PGH2, . . .Foley catherter để giội rửa lấy phôi có nhiều loại, nó cũng thay đổi theo lịch sử phát triển của công nghệ.Foley catherter 2 đườngFoley catherter 3 đườngIII. Phương pháp giội rửa1. Thu hoạch phôi qua phẫu thuật2. Thu hoạch phôi không qua phẫu thuậtCác vị trí và giai đoạn phát triển của phôi có thay đổi chút ít.Tuy vậy theo Kanagawa, Shimohira, Saitoh thì phôi nằm ở ống dẫn trứng 4 ngày sau khi thụ tinh, 1 ngày ở đoạn cuối ống dẫn trứng, giáp sừng tử cung, và từ ngày thứ 6 trở đi mới nằm ở chóp sừng tử cungTHỜI GIAN, VỊ TRÍ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI SAU ĐỘNG DỤC, PHỐI GIỐNG1. THU HOẠCH PHÔI QUA PHẪU THUẬT:a) Phương pháp 1: Dung dịch giội rửa được đưa vào chóp của sừng tử cung và lấy ra ở phía loa kèn ống dẫn trứng. Nước sẽ đi từ gốc ống dẫn trứng đến đầu loa kèn và chảy xuống đĩa petri. Trứng + nước theo dòng chảy được đưa ra ngoài.Ưu điểm: - Lượng nước giội rửa ít (5 - 10 ml) - Ít làm tổn thương ống dẫn trứng và sừng tử cung - Kết quả giội rửa thu phôi caob) Phương pháp 2 Cách dội rửa ngược lại với phương pháp thứ nhất.Ưu điểm: - Lượng nước dội rửa ít( 5-10 hoặc 15ml) - Tỷ lệ trứng ,phôi lấy ra caoNhược điểm: - Làm tổn thương, do có lỗ thủng ở chóp sừng tử cung khi đưa ống hoặc dụng cụ thu phôi vào để hứng nước giội rửa ra.c) Phương pháp 3: Dung dịch giội rửa được đưa vào chóp sừng tử cung, lấy ra ở gốc sừng tử cung. Nuớc dội rửa chảy từ đầu sừng đến cuối sừng tử cung kéo theo cả trứng, phôi đang nằm tự do trong đó ra ngoài. Phương pháp này đòi hỏi lượng lớn dung dịch giội rửa. tỷ lệ trứng và phôi thu được cũng thấp hơn các phương pháp trên.2. THU PHÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHÔNG PHẪU THUẬT Nguyên tắc: Đưa dụng cụ lấy phôi foley catheter qua âm đạo, cổ tử cung vào thân, sừng tử cung, cố định foley catheter tại một vị trí nhất định bằng một bóng khí. Sau đó , dung dịch được đưa vào lấy ra theo hệ thống ống khép kín, hoặc trực tiếp bằng xilanh thông qua foley catheter. Trứng và phôi được đưa ra ngoài trong quá trình rửa. Phương pháp thu phôi không qua phẫu thuật được tiến hành từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau thụ tinh, tốt nhất là ngày thứ 7 và 82.1. Chuẩn bị: - Kiểm tra lại tất cả các dụng cụ. - Đưa bò vào giá cố định tại điểm chuẩn bị sẵn, chú ý là 2 chân trước cao hơn 2 chân sau. - Khám và xác định lại vị trí, hình dạng, kích thước của tử cung.xác định số lượng thể vàng, nang trứng trên buồng trứng. - Dung dịch giội rửa 1000ml/bò và được ngâm hoặc sưởi lên 37oC. Nối các hệ thống của Folry catheter cho đúng. - Vệ sinh bò, đặc biệt là phần âm hộ, hậu môn, đuôi. - Tiêm phong bế gây tê vùng đuôi.Các dụng cụ đã được chuẩn bị sẵn và các kĩ thuật viên đang vệ sinh cho bò.2.2 Kỹ thuật đưa dụng cụ Foley catheter và cố định nó trong tử cung Lau khô sạch âm hộ bò, sau đó lau lại bằng cồn 70o. Các kĩ thuật viên, một người mở âm hộ, một người đưa foley catheter vào trong. Dụng cụ này đã được khử trùng và có kích thước khác nhau tuỳ độ to nhỏ khác nhau của bò cho phôi.- Foley catheter đã đựơc đưa vào tử cung, bóng khí được cố định cách ngã ba thân và hai sừng tử cung khoảng 3,5 cm.Xác định đúng vị trí cần cố định dụng cụ Foley catheter, bơm 10 - 15 ml khí, bóng khí sẽ nổi lên.2.3 Quá trình giội rửa Sau khi đã cố định Foley catheter, nối Foley catheter với hệ thống ống cho dung dịch nước vào và ra. đóng khoá dung dịch chảy ra, mở khoá chảy vào. Khi sừng tử cung đầy dung dịch, đóng khoá, massages nhẹ nhàng tử cung. Đặc biệt là chóp sừng tử cung. Mở khoá, dung dịch sẽ được chảy vào một bình hoặc phễu lọc phôi.- Lượng dung dịch mỗi lần ra vào khoảng 20-50 ml tuỳ kích thước tử cung và bóng khí. Lặp đi lặp lại khoảng 8-10 lần, lượng dung dịch chảy vào và ra khoảng 400-500 ml là đủ cho một lần lấy phôi ở một sừng. Nếu không dùng hệ thống ống dẫn ra vào ta có thể sử dụng xilanh. IV. SOI TÌM PHÔI1. THANH LOÏC LIEÂN TUÏC2. PHÖÔNG PHAÙP LAÉNG ÑOÏNG3. SOI TÌM PHÔI Sau khi được giội rửa ra ngoài, phôi dễ bị ảnh hưởng bất lợi của nhiều yếu tố như: nhiệt độ, ánh sáng, điều kiện dinh dưỡng, vô trùng của dung dịch nuôiVì vậy phải soi tìm phôi càng nhanh càng tốt.Nếu thấy phôi phải chuyển ngay sang dung dịch dưỡng phôi vô trùng đã bổ sung 10 - 20% FCS.Nếu dung dịch nước chảy ra thông qua hệ thống phễu lọc phôi ta có thể tiến hành soi, tìm phôi ngay trên đĩa hệ thống lọc hoặc đổ ra đĩa petri. Nếu dung dịch nước chảy ra đựng vào bình ta có thể thực hiện theo 2 cách :	Thanh lọc liên tụcPhương pháp lắng đọng1/ Thanh lọc liên tụcMục đích làm giảm số lượng dung dịch giội rửa đã thu được và tiến hành soi tìm phôi ngay. Dụng cụ lọc: Emcon Ngoài ra còn có hệ thống của Minitub và của hãng Agtech.Dụng cụ lọc Emcon Cách lọc: Cho dung dịch chảy qua 1 màng lưới bằng thép không rỉ chảy thẳng ra ngoài. Phôi và mảnh vụng của mô sẽ được màng lọc giữ lại trong phểu.12Giữ lại trong phểu lọc 1 lượng dung dịch nhất định.3Tiếp theo đổ vào 1 đĩa petri có chia ô vuông.4Sau đó tiến hành soi2/ Phương pháp lắng đọngĐể dung dịch giội rửa lắng đọng trong bình. Sau 20-30 phút, phôi và mảnh vụn của mô, dịch nhờn đã lắng đọng xuống đáy bình. Dùng hệ thống lọc phôi theo nguyên tắc bình thông nhau, trên dưới. Dung dịch không phôi ở phía trên sẽ chảy ra ngoài.Đổ dung dịch còn lại ra đĩa petri đã chia ô và đem di soi tìm phôi.3/ Soi tìm phôi Đưa đĩa petri lên kính hiển vi soi nổi để tìm phôi. Để thấy phôi nhanh, rõ chỉ cần độ phóng đại của kính từ 12-24 lần. Nhưng để đánh giá, phân loại chính xác phôi cần được độ phóng đại > 64 lần Để tìm phôi nhanh, không lặp lại nhiều lần, người kỹ thuật thường tìm theo dạng chữ chi ngang hoặc dọc dựa theo các ô đã chia ở đĩa petri. Khi thấy phôi phải lặp tức hút ngay chuyển ngay sang dung dịch nuôi cấy, vô trùngCác dụng cụ cần chuẩn bị cho soi tìm phôi.Tủ giữ phôi Kính hiển vi và các dụng cụ cần thiết khác.V. Những yếu tố ảnh hưởng 1. Thời gian tiến hành giội rửa. 2. Phương pháp giội rửa 3. Loại foley catheter và vị trí của chúng 4. Số lượng dung dịch nước giội rửa1. Thời gian tiến hành giội rửa.Kết quả giội rửa ở các ngày khác nhau sau khi rụng trứng sẽ có những kết quả không giống nhau. Điều này được Sreenan và Beehan chứng minh qua bảng sau:Ngày sau động dục34567878,3(22)53,4(10)66,6(15)64,1(68)50(55)45,9(15)Tỷ lệ trứng, phôi giội rửa thu hoạch được (%)Ghi chú: số trong ngoặc là số bò được giội rửa2. Phương pháp giội rửa.Thu hoạch phôi bằng phương pháp phẩu thuật thì cho kết quả cao hơn một chút so với phương pháp không phẩu thuật. Tuy nhiên nó còn phụ thuộc vào từng cá thể và thời điểm giội rửaNhómChỉ tiêuPP không mổPP mổ1 PMSG (1000 IU)- Số lượng bò thí ngiệm- Số trứng rụng bình quân- Số trứng thụ tinh bình quân- Tỉ lệ giội rửa (%)204,72,862,6172,21,879,22 PMSG (2000 IU)- Số lượng bò thí ngiệm- Số trứng rụng bình quân- Số trứng thụ tinh bình quân- Tỉ lệ giội rửa (%)2114,37,655,21710,76,263,9Kết quả so sánh giội rửa lấy phôi giữa phương pháp mổ và không mổ của Newcomb và Ctv (1978) vào ngày thứ 7 sau động dục được thể hiện như sau:Loại foley catherterNếu giội rửa ở ngày thứ 7, foley catheter 3 đường cho kết quả cao hơn, nhưng sang ngày thứ 8 sau động dục foley catheter 2 đường cho kết quả cao hơn.CathterGiống nói chungGiống thuầnNgày 7Ngày 8Ngày 7Ngày 83 đường2 đường64,059,061,044,373,652,850,076,03. Loại foley catherter và vị trí của chúng.Về độ dài ngắn:Độ dài của foley catheter khác nhau thì kết quả thu phôi cũng khác nhau. Loại 3 đường có đường kính 5,8mm, độ dài là 3,2cm thì thu được 27% phôi còn loại có độ dài 70cm thì thu được 54% phôiVề vị trí:Vị trí Foley catheter cách chóp sừng tử cung(cm)Số bò nghiên cứuTỉ lệ trứngphôigiội rửa (%)Tỷ lệ trứng ohôi giội rửa (%)100ml đầu tiên100ml thứ hai100ml thứ ba0-2,52,5-5,05,0-10,0> 10,043145471456,261,338,423,581,469,466,981,518,327,829,818,50,33,33,20Dựa vào bảng trên thì vị trí foley catheter cách chóp sừng tử cung 2,5cm - 5,0cm là thích hợp nhấtVị trí foley catherter và tỷ lệ trứng , phôi giội rửa thu được 4. Số lượng dung dịch nước giội rửaQuá trình giội rửa tốt nhất chỉ cần lượng dung dịch 200 - 400ml ra vào là đủ.VI. Phân loai phôiII. Ñaùnh giaù phaân loaïi phoâiI. Söï phaùt trieån cuûa caùc teá baøo tröùng 1. Cô sôû ñaùnh giaù phaân loaïi phoâi2. Phaân loaïi phoâi3. Ghi cheùp, theo doõiKhi trứng rụng, tế bào trứng đang phân bào giảm nhiểm lần thứ 2 ở kì giữa, sự phân bào này hoàn thành khi tinh trùng vào tế bào trứng tạo thành hợp tử. Hợp tử sau này là phôi sẽ di chuyển xuống tử cungI- Sự phát triển của các tế bào trứng sau khi gây rụng trứng Phôi dâu giàPhôi nang sớm Phôi nang1 t/b2 t/b4 t/b8 t/b16 t/bPhôi dâuSau khi được thụ tinh một thời gian ngắn trứng bắt đầu phân chia theo cấp số nhân, thông thường phôi ở ngày thứ 5 – 6 có 16 – 32 phôi bào trở lên gọi là phôi dâu (Morula)Những tế bào phôi dâu sau đó tiết ra một ít dịch và hình thành nên xoang. Phôi đã tạo thành xoang gọi là phôi nangXoang phôi lớn lên đẩy khối tế bào dồn về một cực, khối tế bào này gọi là mầm phôi, mầm phôi sau này hình thành nên các bộ phận cơ thể. Khối tế bào bao bọc mầm phôi gọi là lớp màng nuôi, sau này hình thành nên hệ thống nhau thaiII- Đánh giá – phân loại phôi1/ Cơ sở đánh giá phân loại phôiCăn cứ vào 3 mặt sau:Hình thái chung của phôi:Kích thước của phôi: kích thước bình thường 100 – 200 micromet Hình dáng phôi: có hình cầu dẹt, nhìn qua kính hiển vi có hình tròn, giới hạn phôi là màng trong suốtb) Mức độ phân chia tế bào Số lượng phôi bào: số lượng này phụ thuộc vào giai đoạn phát triển: đầu tiên là 1 tế bào rồi 2, 4, 8, 16 tế bào cho đến giai đoạn phôi dâu, phôi nangc) Màu sắc của tế bàoMàu sắc có liên quan đến mức độ sống, chết hay thối hóa của các tế bào phôi Độ tâp trung, phân tán và mối liên kết của tế bào phôi: số lượng tế bào tách rời cho thấy mối liên kết lỏng lẻo của các phôi bào2/Phân loại phôi: có 2 cách phân loại phôi Phân loại phôi theo giai đoạn phát triểnPhương pháp này dựa vào giai đoạn phát triển của phôi, ứng với từng giai đoạn là tuổi của phôi và vị trí của nó trong đường sinh dục con cáiCác sự kiệnVị tríThời điểm tính từ khi bắt đầu động dục (ngày)Bắt đầu động dụcRụng trứngThụ tinh, hợp tử2 tế bào4 – 8 tế bào16 – 32 tế bàoPhôi dâu giàPhôi nang sớmPhôi nangPhôi nang ra khỏi màngPhôi nang dàiTiếp xúc với thành tử cungLàm tổBuồng trứngVòi trứngVòi trứngVòi trứngVòi trứngVòi – tử cungTử cungTử cungTử cungTử cungTử cungTử cungTử cung01223 – 44 – 55 – 678 – 910112335Trình tự phát triển của phôi bò Phôi dâu: là những phôi đã phân chia nhiều lần tào thành nhiều phôi bào (> 16 phôi bào) giới hạn giữa các phôi bào rất khó phát hiện, khối tế bào chiếm phần lớn khoảng trống trong phôi; Tuổi phôi khoảng 5 ngày sau thụ tinh (5 ngày tuổi), có vị trí nằm ở vòi trứng hay tử cung Phôi dâu già: là những phôi chứa nhiều hơn 64 phôi bào, chúng liên kết chặt chẽ tạo thành khối, ít có tế bào tách rời. Khối tế bào này chiếm 60 – 70% khoảng trống trong phôiPhôi khoảng 6 ngày tuổi, nằm ở tử cung Phôi nang sớm: là những phôi mà giữa các phôi bào đã hình thành nên xoang, xoang này nhỏ chiếm nhỏ hơn 20 – 30% diện tích của khối tế bào Phôi ở gần 7 ngày tuổi, có vị trí nàm ở tử cung Phôi nang: là những phôi có xoang lớn hơn 50% diện tích khối tế bào và đẩy ép khối tế bào về một cực, màng nuôi đã được nới rộng, tiến sát về phía màng trong suốt.Phôi khoảng 7 ngày tuổi, có vị trí ở tử cung Phôi nang trương nở: Phôi lúc này lớn lên, kích thước đường kính tăng từ 1,2 – 1,5 lần. Màng trong suốt giãn ra mỏng đi đến độ bằng 1/3 lúc ban đầuPhôi có độ tuổi khoảng 8 ngày sau thụ tinh, nằm ở tử cung- Phôi nang vở màng trong suốt: lúc này màng trong suốt vỡ ra, phôi chui ra ngoài hoặc đã chui ra khỏi màng trong suốt, hình dáng của phôi lúc này không cố địnhb) Phân loại phôi theo chất lượngPhương pháp này là dựa vào chất lượng của phôi trong từng giai đoạn phát triển mà phân thành 4 loại: A, B, C, D hay rất tốt, tốt, trung bình, kém hoặc 1, 2, 3, 4 Nhưng trên thực tế người ta thường phân loại như sau:Trứng không thụ tinh: Phôi chậm phát triển: Phôi thối hóa:Tất cả đều không sử dụng được trong cấy truyềnTrứng không thụ tinhPhôi 4 t/b bị thối hóa Phôi có thể sử dụng được: Gồm có phôi dâu, phôi nang đang ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Chia làm 3 loại:+ Loại rất tốt – A: Phôi có hình thái chuẩn, đúng với giai đoạn phát triển. Màng trong suốt tròn đẹp. Khối tế bào đậm, phân chia đều, rõ. Các phôi bào liên kết chặt chẻ với nhau và không có mảnh vụn tế bào. Phôi 8 t/b loại APhôi dâu loại A+ Loại tốt – B: Phôi có hình dáng kích thước tốt, đúng giai đoạn phát triển nhưng khối tế bào không đẹp, không đều, không rõ nét như loại A. Đôi khi có các mảnh vụn tế bào hoặc một số tế bào rời. 2 phôi dâu loại B+ Loại trung bình – C: Phôi loại này có màu sắc phân bổ không đều, các tế bào liên kết lỏng lẻo, nhiều tế bào rời, nhiều mảnh vụn xen kẻ hoặc tụ thành đám nhỏ. Khối tế bào nhỏ hơn bình thường. Màng trong suốt có thể nguyên vẹn nhưng có thể vỡ hoặc không tròn.Phôi dâu loại CTrong đó loại A và B đem cấy khả năng đậu ít kém thua nhau. Hai loại này đều có thể đông lạnh để bảo quản. Loại C là loại phải đem cấy ngay, chúng không thể đông lạnh được, tỉ lệ đậu thai của loại này chỉ đạt dưới 30% Một số hình ảnh tương phản của phôiPhôi 2 t/b tốtPhôi 2 t/b xấuPhôi 4 tế bào tốtPhôi 4 tế bào thối hóaPhôi 8 t/b tốtPhôi 8 tế bào xấuPhôi dâu loại APhôi dâu loại BPhôi dâu loại CPhôi nang tốtPhôi nang xấu3/ Ghi chép, theo dõia) Trong sổ: ghi chép các thông tin về phôi như Ngày lấy phôi Vị trí lấy phôi Số hiệu của bò cho phôi và giống bò cho phôi- Số hiệu và giống của đực giống Số phôi thu được Chất lượng phôi (A, B, C theo từng giai doạn phát triển) Phôi đóng trong bao nhiêu cọng rạ, từng loại, từng màu của nút cọng rạ và số lượng phôi trong mỗi cọng rạ Qui trình đông lạnh bảo quản b) Trên mỗi cọng rạ Trên cọng ra và nút phải ghi được một số thông tin sau- Ngày lấy phôi, vị trí lấy phôi- Giống bò cho phôi, số hiệu bò ch và đực giống- Số lượng phôi, chất lượng phôi- Phương pháp đông lạnhCaùc thaønh vieân thöïc hieän:Nguyeãn thò hoaNguyeãn thuøy LinhTröông Thi TrinhNguyeãn thò Caåm TrangNguyeãn Haø PhöôngLeâ Trung KieânÑinh Ñaèng PhiCAÛM ÔN THAÀY VAØ CAÙC BAÏN ÑAÕ CHUÙ YÙ LAÉNG NGHE