Bài giảng Sinh học - Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đông vật

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCMVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨMGVHD: TRẦN THỊ PHƯƠNG NHUNGNHÓM: 5LỚP: ĐHSH07LTKỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐÔNG VẬTDANH SÁCH NHÓMNguyễn Thị Hạnh Nguyễn Thị HảoTưởng Thị HàLương Thị Ánh TrangPhan Thị Hồng PhiHà Thị Thu ThủyNguyễn Thị Thúy HằngNguyễn Thị Xuân ThảoNguyễn Thị Mỹ ThuậnNỘI DUNGI. Quan hệ giữa tế bào và giá thể nuôiII. Điều kiện lí- hóa trong kỹ thuật nuôi cấy tế bàoIII. Môi trường nuôi cấy tế bào động vậtIV. Kỹ thuật pha môi trường nuôi cấy tế bào động vậtV. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vậtI. Quan hệ giữa tế bào và giá thể nuôi Trong nuôi cấy invitro tế bào sống bám, phát triển và biệt hóa chức năng trong nuôi cấy nhờ bám vào bề mặt giá thể nuôi. + ECM, collagen, lamimin chính là thành phần màng cơ bản trong liên kết mô. Sử dụng các thành phần này bao phủ trên bề mặt nuôi có thể tăng cường sự bám dính của tế bào. + Huyết thanh cũng chứa các nhân tố bám dính ở dạng hòa tan như fibronectin giúp các tế bào nhanh chóng bám vào bề mặt nuôiIII. Môi trường nuôi cấy tế bào động vật3.1. VAI TRÒ CỦA MÔI TRƯỜNG	Cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết (nước, các axit amin, vitamin, khoáng chất, glucose, dung dịch đệm và carbohydrate, huyết thanh ) cho tế bào ổn định và phát triển.Môi trường nuôi cấy giúp tế bào tồn tại và tăng về số lượng qua những lần phân chia3.2. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THƯỜNG DÙNGMÔI TRƯỜNGỨNG DỤNGBasal medium Eagle (BME)Nuôi cấy tế bào với huyết thanhDulbecco’s Modified Eagle’s media (DMEM)Nuôi cấy tế bào nhiễm vius, phát triển với huyết thanh, tăng trưởng nồng độ caoHam’s F12 nutrient mixture (F12)Nuôi cấy tế bào CHO, mật độ thấp, protein huyết thanh thấp.F12 – DMEM (1:1)Nuôi cấy các kiểu tế bào, phát triển có và không có huyết thanhRPMI 1640Nuôi cấy tế bào leukemia người và những tế bào khácNeurobasal mediumNuôi các tế bào thần kinh CNS3.3. THÀNH PHẦN CỦA MÔI TRƯỜNGMuối vô cơHệ đệmCacbonhydrateTạo, cân bằng áp suất Điều hòa điện thế màng nhờ các ion Ca2+ và K+Điều hòa pH trong môi trường nuôi cấy Sử dụng nhiều là glucose và galactoseGiúp phát triển nhiều kiểu tế bào.Là cofactor cho nhiều enzym hoạt độngCần thiết trong môi trương nuôi cấy không huyết thanh: albumin, transferrin, fibronectin và felutinCần thiết trong môi trương nuôi cấy không huyết thanh: cholesterol và steroid.Kẽm, đồng, seleniumvà các tricacboxylic acid trung gian, trong đó selenium là chất giúp tách các gốc oxy tự doVitaminCác protein và peptideAcid béo và lipidYếu tố vi lượng Huyết thanh Cung cấp chất dinh dưỡng quan  trọngCung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích sự tăng trưởng và phân chia.Kích thích sự phục hồi các tổn thương tế bàoCải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.Chống oxy hoáCải thiện tính bám dính của tế bào3.4. CHỌN LỰA MÔI TRƯỜNGMÔI TRƯỜNG THÍCH HỢPGIÁ THỂ NHIỆT ĐỘÁP SUẤT THẨM THẤUpHV. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vậtSơ đồ nuôi cấy THU NHẬN MẪUcắt nhỏ(Chọn lọc mẫu mô quan tâm,cắt bỏ phần mô chết)Tách tế bào bằng cơ học(nghiền,ép)Tách tế bào bằng enzym(ủ...) Cắt nhỏ (Mảnh nhỏ để nuôi)Nuôi mẫu mô sơ cấpNuôi sơ cấp Thu nhận Tế bào mới Nuôi mảnh mô thứ cấp Cấy chuyền Dòng tế bào Trypsin lạnhTrypsin ấmcollagenase Li tâm Tái huyền phùThu nhận mẫu và xử lý mẫu:Mẫu sạch, rửa và sát trùng bằng cồn, bảo quản trong PBSXử lý xơ bộ mẫu mô : rửa nhiều lần bằng dd PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm sau đó cắt bỏ các phần mô chết phần thừa Mẫu mô được cắt thành 2-3mm2.V.2. Tách rời các tế bàoTách bằng cơ họcTách bằng màng lọc tế bàoĐặt mẫu mô trên màng lọc, sử dụng pitton của syrine chà sát mạnh mảnh mô khi đó những tế bào sẽ va chạm vào lưới lọc và tách rời. 	Những tế bào có đường kình nhỏ hơn lỗ lọc sẽ lọt quaTách rời các tế bào bằng enzyme Cầu nối gian bào có bản chất protein, do vậy các protease sử dụng để tách tế bào là những enzym thủy phân protein như: trypsin, collagenase, pronase, dispase hay những tổ hợp khác để tách các tế bào.Tác dụng của enzyme lên tế bào hiệu quả hỏn dùng cơ họcTách bằng phương pháp khácNuôi cấy thu nhận tế bào (1) Dùng pipet hút vào bốn eppenderf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào (2) Li tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi (3) Cho vào mỗi enppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào nuôi bằng vortex (4) Hút dịch huyền phù ở 4 enppendorf cho vào một bình nuôi cấy và bổ sung 1 ml môi trường (5) Ủ ở 37oC tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ thu được các tế bào sơ cấpHuyền phù tế bào sau khi thu nhận được cho vào dụng cụ nuôi .Tùy từng loại tế bào, môi trường và các điều kiện nuôi cấy có thể khác nhau. Thông thường điều kiện nhiệt độ 37oC, 5% CO2 được duy trì ổn định trong tủ nuôi Nuôi cấy phát triển thành mô sơ cấpThu nhận mẫu mô rửa sạch và tách bỏ các thành phần như mỡ, tế bào chết...Sau đó cắt nhỏ 2-3mm2. Đặt trong các đĩa nuôi, sau đó nuôi mô ở nồng độ huyết thanh. Khi các tế bào phát triển và lan rộng ra từ các rìa của mảnh mô Tiến hành tách bỏ mẫu mô và thu được tế bào Cấy chuyềnCấy chuyền rất cần để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên tục. Cấy chuyền bao gồm các thao tác sau: - Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ - Rửa bề mặt giá thể nuôi - Tách tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi - Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới Các tế bào thường được tách rời khỏi bề mặt dung cụ bằng enym trypsin.Tuy nhiên một số tế bào bám không thật chặt nên chỉ cần dùng pipet hút và huyền phù vài lần chúng sẽ tách ra .Cấy chuyền TB bám dínhTách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi.Rửa dụng cụ nuôi với PBS(5ml/bình Roux 25 cm2)Bổ sung dung dịch trypsin(2-3ml/bình Roux 25 cm2)Ủ trong tủ ấm 37C. Thời gian ủ khác nhau phụ thuộc vào từng kiểu tế bàoKhi các tế bào đếu có hình tròn và nổi lên trên bề mặt dung dịch, tiến hành huyền phù với môi trường có bổ sung huyết thanh và rửa tế bào ở 800 vòng/ p trong 5-10 p. Tiếp theo tái huyền phù bằng môi trường nuôi Cấy chuyền huyền phùnuôi cấy các TB trong đĩa flask (1)Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời các cụm TB(2)Tách lấy một lượng huyền phù để đếm hoặc chuyển 200ml 1ml huyền phù vào bình nuôi mới chứa 10ml môi trường phát triển→tái huyền phù cặn vón vào môi trường tươi và lấy một thể tích tương đương lượng TB mong muốn vào các bình→ tiến hành nuôi.V.3. Nuôi cấy thứ cấpNuôi cấy thứ cấp được tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi cấy sơ cấp, chứa kiểu tế bào đơn, tăng sinh lên tục trong nhiều thế hệ.Tế bào động vật sau khi tách khỏi mô được chuyển vào bình nuôi cấy (bình Roux) và ủ ở 36,5oC trong 24h thay môi trường và tiếp tục ủ.V.4. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào không huyết thanhMục đíchTạo sự thích nghi của tế bào với môi trường không huyết thanh và không bổ sung hormoneSử dụng huyết thanh đã được làm giảm hay loại bỏ hoàn toàn các lớp hormone không cần thiếtBổ sung thường xuyên vào môi trường không huyết thanh các nhân tố tăng trưởng, bám dính vào các nhân tố phù hợp khác.Môi trường huyết thanhMôi trường không huyết thanhCung cấp hormone và nhân tố tăng trưởng cần thiết cho chức năng TBBổ sung hormone, các nhân tố tăng trưởngCung cấp nhân tố bám dính (VD: fibronectin, vitronectin)Phủ đĩa với các nhân tố bám dính hay polylysineHoạt động như một hệ đệm pHSử dụng các hệ đệm hữu cơGần, bất hoạt hay tách ra các chất độc. VD: các hợp chất hữu cơ gắn kim loạiSử dụng nước tinh sạch, chuẩn bị môi trường tươi, bổ sung albuminChứa các protein bám làm ổn định và/hay giúp vận chuyển các hormone, các chất dinh dưỡng vào TBBổ sung các protein bám như transferring eruloplasmCung cấp các chất dinh dưỡngSử dụng các môi trường phức tạpChứa các chất ức chế proteaseSử dụng chất ức chế trypsin khi cầy chuyền và thêm các chất ức chế protease thích hợpChứa các nhân tố biệt hóaBổ sung hay không điều hòa sự phát triển TB và biệt hóaChứa các nhân tố gây sự lão hóa trong các TB chuột bình thườngKhông có tác dụng lên sự già yếu TB, các TB phát triển liên tụcThích hợp cho sự phát triển nhiều kiểu TB kể cả TB fibroblastCó thể chọn lọc các kiểu TB quan tâmỨng dụng Nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh là một phương pháp hiệu quả, ít tốn kém so với nhiều phương pháp trong điều trị nhờ ghép tế bào sừng tự thân nuôi cấy. Đây là biện pháp đơn giản, rẻ tiền hơn rất nhiều so với phương pháp nói trên.V.II. Tạo dòng tế bào Kỹ thuật chọn dòng tế bào- Dùng dung dịch trypsin tách rời các tế bào từ đĩa nuôi cấy, tạo huyền phù tế bào.Cấy tế bào vào đĩa nuôi cấy có môi trường mới, với mật độ thấp (khoảng 1000tb/ml)các tế bào cách xa nhau trong đĩa nuôi  nuôi ủ tế bào đến khi chúng phát triển các colony riêng rẻ.Chọn 1 colony TB cần tạo dòng  cô lập colony bằng ống kim loại nặng hút bỏ môi trường trong ống, tách các TB từ colony này bằng trypsin  cấy sang đĩa môi trường mới.Cấy chuyền tế bào(6) Hút 2ml E’MEM cho vào bình Roux, tráng đều lên bề mặt bình Roux có tế bào.(7) Hút vào mỗi bình Roux mới 5ml môi trường E’MEM.(8) Dùng pipette 1ml gắn vào bóp cao su (loại nhỏ) hút sục môi trường và phun đều vào bề mặt bình Roux có tế bào để tạo huyền phù.(9) Hút vào mỗi bình Roux mới 0,5ml dịch huyền phù. Lắc nhẹ, ủ 37,50c trong tủ nuôi.(10) Sau 24h, đổ bỏ môi trường cũ, cho vào bình Roux 6ml môi trường mới để loại bỏ trypsin và những tế bào chết. Các phương phápPhương pháp ống syringePhương pháp pha loãng tới hạnDùng môi trường không huyết thanhPhương pháp ống syringeNguyên vật liệu: TB nuôi, đĩa 10 mm, môi trường phát triển và môi trường có điều kiện, buồng đếm hồng cầu, các ống syringe, pipette 100l và đầu tip vô trùng.Tiến hành:Tách các TB bằng trypsin.Tái huyền phù trong 5ml môi trường phát triển.Đếm một thể tích tế bào.Chuẩn bị huyền phù để đạt 500-1000 TB/ml.Thêm 1ml dịch huyền phù tế bào vào mỗi 2 – 4 đĩa 100mm hút nhả bằng pipette vài lần để tách các tế bào riêng rẻ.Ủ trong tủ ấm  quan sát bắt đầu vào ngày thứ 5.(12) Sử sụng pipette 100µl pha loãng trypsin với 75µl môi trường phát triển và cẩn thận hút đảo nhẹ khi kiểm tra dưới kính hiển vi.(13) Thêm 400µl môi trường tăng trưởng vào giếng.(14) Lấp đầy các giếng với nước cất vô trùng hay PBS.(15) Ủ ở 370c và kiểm tra sự phát triển hằng ngày.Sử dụng buồng đếm hồng cầu(3) Phủ buồng đếm với lamelle và cho một giọt huyền phù tế bào bằng Pasteur pipette vào góc lõm hình chữ “V”.(4) Đặt buồng bếm lên kính hiển vi quang học.(5) Chỉnh kính ở vật kính 4X, định vị buồng đếm trên thị trường.(6) Buồng đếm chứa ô vuông 1mm được chia thành 25 ô nhỏ. Thể tích của 1 ô là 0,1mm3 hay 10-4ml. Sử dụng vật kính 10x để đếm.(7) Khi tập đoàn phát triển chừng 50-100 TB, có thể “nhặt ra”, chắc chắn rằng các tập đoàn chọn lọc đủ xa khỏi các “hàng xóm cũ” của nó để vòng nhẫn tạo dòng sẽ chỉ chứa một tập đoàn duy nhất.(8) Hút bỏ môi trường  rửa với 5ml PBS.(9) Trét mặt dưới 1 ống syringe một lớp mỡ silicone đã hấp khử trùng  dùng kẹp đặt syringe vào đĩa  ấn nó xuống để chắc chắn nó được gắn tốt.(10) Tiếp tục đến khi có 5-10 tập đoàn/đĩa được chọn và bao phủ đều.(11) Dùng pipette 100µl hút 25µl trypsin cho vào mỗi syringe  ủ đến khi các tế bào trở nên tròn và nổi lên khi kiểm tra dưới kính hiển vi.Quy trình xây dựng đường cong tăng trưởng Nguyên vật liệu: TB nuôi cấy, 10 đĩa nuôi 60mm, môi trường tăng trưởng 55ml, các hóa chất nhuộm, trypsin/EDTA, chất ức chế STI (nếu dùng trong môi trường không huyết thanh).Tiến hành:Tách các TB bằng trypsin.Tái huyền phù các TB trong 10ml môi trườngRửa bằng cách li tâm trong các ống li tâm, 900 vòng/phút, 3-4p.4) Tái huyền phù các cục vón trong 5ml môi trường, tách một lượng nhỏ để đếm. Quy trình xây dựng đường cong tăng trưởng(5) Pha loãng lượng TB thích hợp vào 55ml môi trường tăng trưởng để có tổng số tế bào là 5,5x105.(6) Tái huyền phù các giếng và thêm 5ml vào mỗi giếng. Kết quả nồng độ tế bào đạt 5x104 TB/đĩa(7) Đếm số lượng tế bào còn trong 5ml huyền phù để xác định nồng độ thật.(8) Đặt các đĩa vào tủ ấm 370c.(9) Đếm các tế bào cứ sau 24h.(10) Sau lần đếm cuối, vẽ đồ thị các kết quả thành các đường thẳng. Hiệu quả trảiHiệu quả trải được tính bằng công thức:(Số tập đoàn hình thành/số tế bào đem trải) x 100% = hiệu quả trảiNguyên vật liệu: TB nuôi cấy, đĩa 100mm, ống li tâm 15ml, 60ml môi trường phát triển, dung dịch trypsin, chất ức chế STI, buồng đếm hồng cấu, 10% formalin, crystal violet.Hiệu quả trảiTiến hành:(1) Dùng trypsin tách TB, kiểm tra chắc chắn rằng tất cả đều là tế bào đơn.(2) Trung hòa enzym bằng cách tái huyền phù thành 10ml môi trường có huyết thanh trong ống nghiệm 15ml, hoặc thêm vào 1ml STI và tái huyền phù trong 10ml môi trường phát triển không huyết thanh.(3) Rửa bằng cách li tâm ở 900 vòng/phút trong 3-4 phút  tái huyền phù trong 5-10ml môi trường phát triển.(4) Đếm TB với một lượng mẫu thích hợp.(5) Xác định thể tích cần thiết để có được 100, 500, 1000 TB  cho vào đĩa 100mm.(6) Tái huyền phù các TB trong 10ml môi trường bằng cách sử dụng pipette hút nhả liên tục vài lần để chắc chắn rằng các tế bào đều đã được tách riêng rẻ  trải các TB này vào đĩa nuôi 100mm.(7)Ủ các đĩa vào trong tủ ấm đến khi các tập đoàn đủ lớn để có thể quan sát bằng mắt thường. Thời gian cần thiết để ủ khoảng 10 ngày.8) Rửa các đĩa bằng PBS  thêm formalin 10% sao cho bao phủ cả bề mặt đĩa  cố định trong 10p.(9) Tách lấy formalin và thêm dung dịch crystal violet (2-3ml) để bao phủ đĩa  để 10p  tách các crystal violet và rửa dưới dòng nước chảy đến khi mất màu.(10) Đếm số lượng colony bằng bút mực hay sử dụng máy đếm colony.V.5. Kỹ thuật nuôi cấy TB trên giá thể 3 chiềuCác đặc tính lí tưởng của scaffold Có cấu trúc lỗ xốp bên trong ( đường kính lỗ ít nhất 60-100um) cung cấp dưỡng chất giúp tăng trưởng mô , phân bố mạchĐược chê tạo từ vật liệu có khả năng tự phân hủy sinh học , hoặc khả năng hấp thụ sinh học được kiểm soát , để sau đó mô sẽ thay thế scaffold.Có hóa học bề mặt thích hợp để giúp các tế bào bám , biệt hóa và tăng sinh.Có các đặc tính cơ học thích hợp để tương xứng với vùng ghép.Không kích thích bất kì phản ứng có hại nào.Dễ tạo hình dáng và kích thước mong muốn. Hệ thống nuôi cấy tế bào 3D Kĩ thuật nuôi tế bào 3D được ứng dụng nhằm phát triển các mô và cơ quan thay thế. Các kĩ thuật này liên quan đến việc đưa các tế bào và các nhân tố tăng trưởng vào trong cá scaffold tổng hợp ( hoạt động như ECM tạm thời) để giúp các tế bào tổ chức thành mô khác nhau ( da , sụn , gan , thần kinh, mạch), hay thậm chí là cả cơ quan.Vật liệuPolyme tự nhiên Các polymer là protein hoặc là carbohydrate có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng làm scaffold cho sự tăng trưởng của vài loại mô. Polymer tự nhiên phổ biến nhất được sử dụng tạo scaffold kĩ nghệ mô là collagen Polyme tổng hợp Các polyester như polyglycolic acid (PGA) , polylactic acid (PLA) , các copolymer ( PLGA) và polycaprolactone (PCL) thường được sử dụng để thiết kế các scaffold.Phương pháp chế tạoLọc gián đoạn qua khuôn dung môi Bọt khí : Mạng lưới sợi .Tách pha Làm khuôn tan chảy Làm khô lạnh nhũ tương Đúc khuôn dung dịch Làm khô lạnhCác hạn chế của scaffold kĩ nghệ môVi môi trường scaffold không lý tưởng cho sự tăng trưởng mô .Không thể kiểm soát chính xác kích thước và hình dạng lỗ, sự phân bố không gian của các lỗ và cấu trúc các kênh bên trong scaffold .Tạo ra các scaffold có cấu trúc lỗ xốp ,phương pháp này chỉ tạo ra các mô tăng trưởng in vitro có thiết diện dưới 500m từ bề mặtLàm giảm số tế bào tiên phong di cư sâu vào bên trong scaffold. Đối với kĩ nghệ mô xương, tốc độ chuyển dưỡng chất và oxy nhanh tại bề mặt scaffold kích thích sự khoáng hóa bề mặt scaffold, làm hạn chế sự chuyển khối vào bên trong scaffold. khi tế bào đã phân bố khắp scaffold quy mô lớn , vẫn cần cung cấp mạch máu để nuôi dưỡng các tế bào ở sâu bên trong scaffold.Kĩ thuật chế tạo dạng tự do rắn Hệ thống in ba chiều Hệ thống Stereolithography Hệ thống mô hình lắng đọng hợp nhất Hệ thống Plotter 3DHệ thống in phun đổi phase