Bài giảng Sinh học - Liệu pháp gen

Nguyễn Phú Hùng Nature and Society Faculty of Thai Nguyen University Liệu pháp gen1. Mốc lịch sử	Ngày 14-9-1990, viện sức khỏe quốc gia Mỹ (U.S.National Instituse of Helth) thử nghiệm liệu pháp gen đầu tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên là severe combined immune deficiency SCDI (thiếu hụt hệ thống miễn dịch nghiêm trọng)..Tách tế bào bạch cầu ra khỏi cơ thểG ắn gen thi ếu v ào t ế b àoĐ ưa trở lại máuT ăng hệ thống mi ễn dịch Liệu pháp gen là sự thay thế một gen lành vào vị trí của gen bệnh hoặc bổ xung gen lành tương ứng vào cơ thể bị bệnh.   2. Khái niệm về liệu pháp genCách 1: Thay thế gene bệnh bằng gen lànhƯu:Nhược:Có tính chất triệt đểKhó thực hiệnCách 2: Thêm gene lành để bổ trợ cho gen hỏng: Ưu: - Nhược:Dễ thực hiệnNguy hiểm: Không nằm trong phức hợp điều hòa – biểu hiện tùy tiện1Gây hiệu quả không mong muốn2 hoạt hóa một gen tiền ung thư thành gen ung thư3Liệu pháp gen tế bào somaLiệu pháp genGồm hai nhómLiệu pháp gen tế bào sinh dục3. Phân loại liệu pháp gen4. Có 3 mức khác nhau của liệu pháp genGen chuyển hòa nhập DNA nhiễm sắc thể vật chủ1Gen chuyển không hòa nhập DNA nhiễm sắc thể vật chủ2 Sử dụng các oligonucleotit tổng hợp nhân tao (ribozyme/antisense)35. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen	Sử dụng các vector virus đã biến đổi để chuyển gen vào tế bào theo 4 bước:Bước 2Bước 3Bước 1Bước 4Nhân dòng gen trị liệu(gen đích)Theo dõi sự hoạt động của gen đíchTạo vector tái tổ hợp phù hợpĐưa vector tái tổ hợp, vào cơ thể 3Lựa chọn phương thức( có thể tiến hành invitro Sau đó cấy ghép vào cơ thể hoặc chuyển trực tiếp vector vào mô bệnh)1Có bản sao đầy đủCó trình tự điều hòa(trình tự khời động)Trình tự khởi động có thể đặc hiệu mô2Lựa chọn kỹ thuật đích6. Các yêu cầu chung về mặt kỹ thuật trong liệu pháp genGắn trực tiếp DNA trần vào tế bào cấySử dụng vector virus để đưa gen vào tbbàoChuyển gen thông qua phức hệ hóa học7. Vector virus trong chuyển gen3Các virus khác nhau có tính chất chuyển gen khác nhau: tế bào nhiễm, in vivo hay in vitro, thời gian biểu hiện gen, mức độ biểu hiện gen, vấn đề an toàn)1Virus cho phép chuyển gen đặc hiệu tế bào thông qua tương tác virus – thụ thể tế bào2Virus có thể cho phép mang được những đoạn gen có kích thước tương đối lớn từ 5 – 30 kb (tùy từng loại vector virus cụ thể)Hiện có một số dạng vector virus chính: Retrovirus, Adenovirus, Adeno – associate virus, lentivirus và Herpes simplex virusKích thước nhỏChuyên trở bề mặt thấpVòng đời dàiVector đi vào máu theo sự lưu thông dòngVectorThành tế bào máuTế bào bệnhCác đặc tính của vector:Các rào cản đố với hiệu quả truyền vectorNhânMàng tế bàoRNARNAVectorDNAProtein chữa bênh7.1. Vector Adenovirus- Thuộc họ AdenoviridaeHiện có khoảng trên 50 type huyết thanh đã được biếtGenome có bản chất là DNA sợi kép, mạch thẳng. Có trình tự lặp lại đảo ngược (invert - ITR). Kích thước 33 – 45 kb- Cấu trúc đối xứng 20 mặt điển hình3 loại kháng nguyên chính: penton, hexon, và sợi (fiber)Các gen trong genome của virusCác gen sớm(biểu hiện trước khi sao chép): E1a, E1b, E2a, E3 và E4:- E1a điều hòa phiên mã, E2 và E3 và E4 điều hòa dịch mãCác gen muộn: L1, L2, L3, L4, L5. chỉ biểu hiện sau khi khởi đầu sao chép DNACác gen trung gian: B2b và IV92Nếu Loại bỏ E1 sẽ làm hỏng khả năng tái bản của virus bởi sản phâm gen E1 cần thiết cho sự điều hòa quá trình phiên mã. (điều khiển các promoter của các gen muôn E2, E3 và E4 (MLP).Các gen E1, E2, và E4 được hoạt hóa bởi các nhân tố phiên mã nội sinh tế bào chủ. Vector thế hệ 3 ngoài 	vùng E1 và E3 thì vùng mã hóa cho protein E2a cũng bị xóa. Giản đồ sắp xếp các gen trong genome của AdenovirusThiết kế vetor thế hệ đầu tiênSử lý DNA virus bằng enzyme giới hạn sau đó tinh sạch thu đoạn DNA lớnTái tổ hợp tương đồngSàng lọc và phân tíchXử lý DNA virus bằng enzyme cla I, chuyển đồng thời với DNA plasmid mang gen đích vào tế bào nuôi cấy 36 Kbp DNA Ad GenomeE1AE3 E1BE2AE4E2BL1L2L4L3L5Gen đích Chữa bệnhVector adenovirus thế hệ đầuKhiếm khuyết khả năng tái bảnE1AE3 E1BE2AE4E2BL1L2L4L3L5Vector thế hệ gần đâyGen chuyểnDNA chèn vàoDNA chèn vàoITRITRMột số đặc tính cơ bản của vector adenovirrusCó thể tiên hành in vitro hoặc tiêm trực tiếp vào cơ thể Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kb Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kbMang đoạn gen khoảng 8 kbCó tính đặc hiệu mô, nhiễm vào các tế bào không phân chiaLiều lượng 108 – 1010 cfu/mLThời gian biểu hiện gen ngắn (vài tuần), mức độ biểu hiện gen cao7.2. Vector AAV (adeno – associated Virus)Thuộc họ parvoviridaecó 5 họ phụ- Kích thước genome nhỏ- Không có khả năng tự nhân lên􀂃 Adeno-associated virus 1 	Non-human primates􀂃 Adeno-associated virus 2 	Humans􀂃 Adeno-associated virus 3 	Humans 􀂃 Adeno-associated virus 4 	Non-human primates􀂃 Adeno-associated virus 5 	Humans􀂃 Adeno-associated virus 6	Humans 􀂃 Adeno-associated virus 7 	Non-human primates 􀂃 Adeno-associated virus 8 	Non-human primates 􀂃 Adeno-associated virus 9 	Non-human primates 􀂃 Adeno-associated virus 10 	Non-human primates 􀂃 Adeno-associated virus 11 	Non-human primatesCó khoảng 11 type huyết thanh khác nhauTổ chức genome và vectorThiết kế vector AAVThiết kế vector AAVITRITRp5p19p40repcapAAV Genome AAV VectorWith TransgeneTransgeneITRITRCMVPoly(A)Thiết kế vector AAVTập hợp các nhân tố phiên mãPhiên mã và dịch mãProtein gắn kết vơi DNAĐặc tính của vectorGhép nối (hợp nhất) vào nhiễm sắc thể Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kb Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kbMang đoạn gen khoảng 4,5 -5 kbHợp nhất trong các tế bào không phân chia, không đặc hiệu môMức độ biểu hiện vừa phải, Tính độc của protein RepTiêm trực tiếp vector vào cơ thể vật chủĐưa vetor vào tế bào nuôi cấy7.3. Vector RetrovirusĐược sử dụng trong khoảng 60% dự án liệu pháp genThuộc họ retroviridaeGenome của retrovirusSự nhân lên của virus trong tế bàoThiết kế vector RtrovirusThiết kế vector RtrovirusĐặc tính của vectorGhép nối (hợp nhất) vào nhiễm sắc thể Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kb Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kbMang đoạn gen khoảng 8 kbHợp nhất trong các tế bào đang phân chia, Có tính đặc hiệu mô, có thể nhiễm trực tiếp hoặc ExvivoMức độ biểu hiện vừa phải, Có thể gây đột biến genLiposomes vectorLiposomes vectorLiệu pháp gen điều trị HIVI. Liệu pháp kìm hãm HIV nội bào3Liệu pháp miễn dịch1Liệu pháp dựa trên cac axit nucleic của virus2Liệu pháp dựa trên các protein nội bàoAntisense (tar mRNA): Rev (vân chuyên RNA), Pol 1Ribozyme2Liệu pháp dựa vào axit nucleic của virusLiệu pháp dựa trên protein nội bàoDominant negative protein Gắn cạnh tranh với mRNA, các nhân tố phiên mã, trung hòa virus1Gen tự sát 2I. Liệu pháp miễn dịchVaccine DNAVaccine DNAThách thức về công nghệEfficacy & SafetyNgày 17 tháng 10 năm 1999, một bệnh nhân 18 tuổi người pháp mắc bênh thiếu hụt em eyme ornithine transcarbamylase (OTC) đã bị chết sau khi được ddieuf trị bằng liệu pháp gen với vector adeno virus. Khi đưa vector này vào cơ thể đã dẫn tới hiên tượng phản ứng viêm bất ngờ và gây tổn thương hàng loạt cơ quan, hôn mê và chếtPhase III EfficacyClinical PKCommercial Scale-upBLA FilingPhase I/II ToxicityIND FilingTinh chếcGMP sản xuấtQuá trình phát triểnQA & QCHiệu lực ban đầuKiểm tra ban đầSản xuất thửHiệp đồng phát triển sản xuấtgiảm thời gian và giá cảThời gianSản phẩm đặc biệtChung cho các quá trình sản xuấtSản xuất các dược liệu thông thươngTimeSản phẩm liệu pháp genProduct Development Synergies Reduce Time and CostProduct-SpecificCommon to all productsSự phát triển của liệu pháp gen hiện nayUSA505Canada11Japan4China2Australia2New Zealand1Nước khác Tổng số636Gene Therapy Clinical Trials.  (2003). Việt Nam vào năm nào?Ai làm?