Đề tài: Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

ĐỀ TÀI: SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬTGVHD : Văn Hồng Thiện SVTH : Nhóm 6Lớp : ĐHPT7LTBÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCMKHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌCDANH SÁCH NHÓM Nguyễn Thị Thu Hiền	MSSV: 11275371Nguyễn Thị Kim Thoa	MSSV: 11318651Lê Văn Tươi	MSSV: 11318851Lê Thị Bích Thẩn	MSSV: 11327401NỘI DUNGCÁC KHÁI NIỆMSỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT TRONG CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY KHÁC NHAUCÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬTẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ BÊN NGOÀI ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT* Sinh trưởng:	Ở vi sinh vật, sinh trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng tế bào ( sự tăng sinh khối). 1. CÁC KHÁI NIỆM* Phát triển:	Phát triển là sự tăng số lượng tế bào ( sự sinh sản)* Nồng độ vi khuẩn (tb/ml):Số tế bào vi khuẩn có trong 1 ml mẫu khảo sát.* Mật độ vi khuẩn (mg/ml):	Khối lượng vi khuẩn có trong 1 ml mẫu khảo sát.* Thời gian thế hệ:Là thời gian cần cho số lượng tế bào vi khuẩn tăng lên gấp đôi.Hằng số tốc độ phân chia tế bào:Số lần tăng gấp đôi của nồng độ vi khuẩn trong 1 giờ.* Có 2 phương pháp nuôi cấy cơ bản: - Nuôi cấy tĩnh:- Nuôi cấy liên tục:2. SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT TRONG CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY KHÁC NHAU- Nuôi cấy tĩnh: Trong suốt thời gian nghiên cứu ta không thêm vào bất kỳ chất dinh dưỡng nào và cũng không loại bỏ sản phẩm của quá trình trao đôi chất.2.1 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TĨNHĐường cong sinh trưởng trong hệ thống kín (Theo sách của Prescott, Harley và Klein)- Sinh vật sinh trưởng và phát triển trong môi trường nuôi cấy tĩnh được chia làm 4 pha:- Từ lúc bắt đầu cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Đặc điểm:+ Tế bào chưa phân chia.+ Thể tích và khối lượng tế bào tăng lên.- Độ dài của pha mở đầu phụ thuộc vào:+ Tuổi giống cấy.+ Lượng cấy giống.+ Thành phần môi trường.2.1.1 PHA MỞ ĐẦU ( PHA LAG)(a) Sinh trưởng kép của E-coli trong môi trường glucose và sorbitol.(b) Sinh trưởng kép của E-coli trong môi trường amoni và nitrat.- Vi sinh vật bắt đầu phân chia theo cấp số nhân (2n)- Giai đoạn “ tế bào chuẩn”- Pha này kéo dài 5 – 12 giờ.2.1.2 PHA TĂNG TRƯỞNG ( PHA LOG)                                                                                                                                                                                                 Nồng độ chất dinh dưỡng và sinh trưởng(a )- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng đối với sản lượng chung của vi sinh vật. Lúc nồng độ đủ cao thì sản lượng chung sẽ đạt tới ổn định.(b)- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng.- Công thức tính số lượng tế bào sau n lần phân chia: N = N0 x 2n = N0 x 2Ct- Trong đó: 	N : số tế bào tạo thành sau n lần phân chia.	N0 : số tế bào ban đầu.	n: số lần phân chia.	C: hằng số tốc độ phân chia ( hay số lần phân chia sau 1 giờ.	t: thời gian phân chia ( thời gian để được N tế bào)- Ví dụ: 1 tế bào E-coli sau 20 phút phân chia 1 lần.Thời gianSố lần phân cắt2nSố lượng (N0 x 2n)lg10 Nt0020=110,00020121=220,30140222=440,60260323=880,90380424=16161,204100525=32321,505120626=64641,806Bảng 1: Giả thiết là nuôi cấy từ 1 tế bào E-coliSự sinh trưởng theo lũy thừa của các VSV đơn bào ( với N là số tế bàoI: phương pháp thông thường biểu diễn kết quả.II: phương pháp biểu diễn theo logarit- Số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi. - Tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. - Pha này kéo dài vài giờ đến vài ngày.2.1.3 PHA ỔN ĐỊNH ( PHA CÂN BẰNG)Số tế bào không thay đổi trong pha cân bằng- Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa (mặc dù số lượng tế bào sống tổng cộng có thể không giảm). - Ở các vi khuẩn sinh bào tử hình thành phức tạp hơn do qua trình hình thành bào tử. 2.1.4 PHA TỬ VONGSố tế bào không giảm nhanh trong pha tử vongBảng 2: Thời gian thế hệ của một số loài vi sinh vậtVi sinh vậtNhiệt độ (0C)Thời gian thế hệ (giờ)Vi khuẩn và Vi khuẩn lamBeneckea natriegens370,16Escherichia coli400,35Bacillus subtilis400,43Staphylococcus aureus370,47Pseudomonas aeruginossa370,58Clostridium botulinum370,58Rhodospirillum rubrum254,6-5,3Anabaena cylindrica2510,6Mycobacterium tuberculosis37Khoảng 12Treponema pallidum3733Vi sinh vậtNhiệt độ (0C)Thời gian thế hệ (giờ)TảoScenedesmus quadricauda255,9Chlorella pyrenoidosa257,75Asterionella formosa209,6Euglena gracilis2510,9Ceratium tripos2082,8Động vật nguyên sinhTetrahymena geleii242,2-4,2Leishmania donovani2610-12Paramecium caudatum2610,4Acanthamoeba castellanii3011-12Giardia lamblia3718NấmSaccharomyces cerevisiae302Monilinia fructicola2530Bảng 3: Thời gian thế hệ của một số loài vi sinh vật2.2 NUÔI CẤY VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG LIÊN TỤC- Nuôi cấy liên tục: Đưa liên tục môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy đồng thời loại khỏi bình một lượng dịch tế bào.Hệ thống nuôi cấy liên tục ( Chemostat) Nuôi cấy liên tục trong Chemostat và Turbidostat* Cách tính số tế bào đưa vào và số tế bào ra khỏi bình như sau:Ta có:Thể tích bình là V(l), tốc độ dòng đi vào và ra là f (l/giờ). Ta có độ pha loãng D = V*fNếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển thì:V- = D*x ( x là sinh khối tế bào (g/l))Nếu vi khuẩn sinh trưởng và phát triển thì số lượng vi khuẩn trong bình tăng và phụ thuộc vào µ V+ = µ * x ( µ: hằng số tốc đọ sinh trưởng)- Sự sai khác giữa tốc độ tăng (V+)và tốc độ giảm (V- ):V = V+ - V- = (µ - D)*xV > 0 nếu µ > D: mật độ vi khuẩn trong bình tăng.V < 0 nếu µ < D: mật độ vi khuẩn trong bình giảm.V = 0 nếu µ = D: số vi khuẩn ra khỏi bình bằng số vi khuẩn đưa vào.- Cần chú ý đến hệ số pha loãng của môi trường sao cho nồng độ cơ chất trong môi trường vào và ra khỏi bình luôn bằng nhau.Hệ thống nuôi cấy liên tục ( Chemostat) Tỷ lệ pha loãng trong chemostat và sinh trưởng của vi sinh vậtHệ thống nuôi cấy liên tục ( Turbidostat) Hệ thống nuôi cấy liên tục ( Turbidostat) 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 3.1. Xác định số lượng tế bào.- Đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi .- Phương pháp đếm khuẩn lạc.- Phương pháp màng lọc (membrane filter) .- Phương pháp MPN (most probable number).3.2. Xác định khối lượng tế bào.- Phương pháp trực tiếp.- Phương pháp gián tiếp.* Đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi .Phòng đếm Petroff-Hauser 1- Pha loãng mẫu cần đếm sao cho mỗi ô có khoảng 5 – 10 tế bào.3.1 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO2- Đặt buồng đếm dưới kính hiển vi.Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu trên kính hiển viCách đếm tế bào trong buồng đếm* Phương pháp đếm khuẩn lạc1- Cấy và trải đều 1 ml mẫu trên đĩa.2- Ủ ở nhiệt độ thích hợp.3- Đếm số khuẩn lạc.Máy đếm khuẩn lạcColony starMáy đếm khuẩn lạc tự động ColonyDoc-it Imaging Station * Các thiết bị đếm khuẩn lạcTính kết quả:N: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên 1 hộp petri đã chọn.ni:số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i.di: hệ số pha loãng tương ứng. V (ml): thể tích dung dịch mẫu cấy cào trong mỗi đĩa petri.Công thức tính* Phương pháp màng lọc (membrane filter) Bộ lọc và màng lọc vô trùng* Phương pháp màng lọc (membrane filter) - Kích thước lỗ lọc: 0,45 m hoặc 0,2 m- Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc* Phương pháp màng lọc (membrane filter) Quy trình: 	- Khử trùng dụng cụ lọc	- Lọc chân không	- Nuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡng	- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petriTính mật độ:	MPN = N x ln(N/N - x)	Với: N: Tổng số các ô vuông	 x: số ô có khuẩn lạc mọc	* Phương pháp màng lọc (membrane filter) 1A1B1C1D. 2A2B2C2CE. coli trên môi trường ID Coli agarColiforms trên môi trường ID Coli agar* Phương pháp màng lọc (membrane filter) * Phương pháp màng lọc (membrane filter) * Phương pháp màng lọc (membrane filter) * Phương pháp màng lọc (membrane filter) * Phương pháp màng lọc (membrane filter) Vi khuẩn phát triển trên màng lọc* Phương pháp màng lọc (membrane filter) * Phương pháp MPN (most probable number). Hai hệ thống MPN	- Hệ thống 9 ống	- Hệ thống 15 ống Đặc điểm- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như	Sự tạo hơi: Coliforms 	Sự đổi màu: S. aureus- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớnSự đổi màu: S. aureusSự sinh hơi: E.coli* Phương pháp MPN (most probable number). Hệ thống 9 ống10ml môi trườngHệ thống 15 ống* Phương pháp MPN (most probable number). Quy trình: 	- Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp.	- Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu.	- Ủ ống nghiệm ở điều kiện thích hợp.	- Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của VSV.	- Ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng ( 3 lần pha loãng liên tiếp)	- Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV* Phương pháp MPN (most probable number). 1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.510-110-210-31ml1ml1ml521Tra BảngSố vsv: 70 MPN/ml* Phương pháp MPN (most probable number). 521Tra bảngSố vsv: 70 MPN/gKết quả* Phương pháp MPN (most probable number). Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSVTính mật độ:	Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x x d Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady V2: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1) V1: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml) d: độ pha loãng ở loạt ống đầu tiên* Phương pháp MPN (most probable number). 3.2 Xác định khối lượng tế bào.* Phương pháp trực tiếp:- Xác định sinh khối tươi hoặc sinh khối khô (phương pháp này kém chính xác) - Xác định hàm lượng nitơ tổng số theo phương pháp micro- kjehdal hay hàm lượng cacbon tổng số theo phương pháp của Van Slike- Folch (các phương pháp này cho độ chính xác cao). - Xác định hàm lượng protein của vi khuẩn bằng phương pháp Biure cải tiến hoặc phương pháp so màu. 3.2 Xác định khối lượng tế bào.* Phương pháp gián tiếp:- Phương pháp nhanh: đo độ đục của dịch treo tế bào. - Đo các chỉ số cường độ trao đổi chất như hấp thụ O2, tạo thành CO2 hay axit, vì các chỉ số này liên quan trực tiếp tới sự sinh trưởng. Đo số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục.4. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ BÊN NGOÀI ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 4.1 Cơ chế tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên vi khuẩn.4.2 Yếu tố vật lý.4.3 Yếu tố hóa học.4.4 Yếu tố sinh học.4.1 Cơ chế tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên vi khuẩn.- Tác dụng có hoại của các yếu tố bên ngoài đến tế bào vi khuẩn.+ Phá hủy thành tế bào.+ Biến đổi tính thấm của màng tế bào chất+ Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất+ Kìm hãm hoạt tính men+ Hủy hoại các quá trình tổng hợp4.2. Ảnh hưởng của yếu tố vật lý- Độ ẩm môi trường- Nhiệt độ môi trường.- Áp lực của môi trương.- Âm thanh.- Sức căng bề mặtẢnh hưởng của nhiệt độ môi trườngđến tốc độ sinh trưởng vủa VSV4.3. Ảnh hưởng của yếu tố hóa học- Ảnh hưởng của pH- Ảnh hưởng của các chất diệt khuẩn ( sát trùng).4.3. Ảnh hưởng của yếu tố sinh học- Quan hệ cộng sinh- Quan hệ hỗ sinh - Quan hệ ký sinh - Quan hệ đối kháng