Kiểm nghiệm vi sinh trong nước sinh hoạt

Semina:CNSH VI SINH VẬTKIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG NƯỚC SINH HOẠTGVHD:Nguyễn Thị Kim CúcNhóm: WAO_OneLớp :50SHTRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANGVIỆN CNSH & MTNội dungI./ Vai trò của nước: Đối với cơ thể sống:Là một dung môi quan trọng nhất trong tế bào sống.Nước tham gia như một thành phần rất quan trọng trong cấu trúc của tế bào.Nước tham gia vào các phản ứng thủy phân & các phản ứng oxy hóa trong tế bào.Nước như là một bộ xương có tính chất đệm tạo nên khung mềm của tế bào, ở đó các cơ quan tồn tại & hoạt động sinh lý bình thường.Nước tham gia quá trình điều hòa nhiệt của cơ thể.Nước tham gia bôi trơn các bộ phận của đường tiêu hóa, đường hô hấp, các khớp xương. Trong sinh hoạt: Nước là một nhu cầu sống không thể thay thế được. Nước cung cấp cho các hoạt động của tế bào, mô, cơ thể, cũng như cho các nhu cầu về tắm, giặt, vệ sinh nhà cửa Trong sản xuất: Nước là một loại nguyên liệu rất đặc biệt, một loại nguyên liệu không thể thay thế. Nước dùng trong sản xuất chủ yếu là dùng vào hoạt động sản xuất nông nghiệp & sản xuất công nghiệp, trong đó nước dùng trong nông nghiệp chiếm trên 70%.Tóm lại nước rất quan trọng trong đời sống, không thể thiếu được và càng nghiêm trọng hơn nếu nước bị ngộ độc, hay bị ô nhiễm. I./ Vai trò của nước:II./ Những chỉ tiêu tiêu chuẩn trong nước sinh hoạt:Tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam (TCVN 5942-1995) quy định nguồn cấp nước sinh hoạt nhưng phải qua quá trình xử lý giới hạn tối đa coliforms cho phép 5000MPN/100ml.Tiêu chuẩn bộ y tế (QCVN 02: 2009/BYT): Coliform tổng số vi khuẩn /100ml: 50 E. coli hoặc Coliform chịu nhiệt vi khuẩn /100ml: 0III./ Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật:1/Coliforms:Coliforms là những trực khuẩn gram âm, hình que, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý.Có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ở 37oC trong 24 - 48h.Nhóm Coliforms gồm 4 nhóm:	+ Escherichia (E.coli)	+ Citrobacter	+ Klebsiella	+ Enterobacter2/ Coliforms chịu nhiệt:Là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi được ủ ở 44oC trong môi trường EC.3/ Coliforms phân (E.coli giả định):- Là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24h ở 44.5oC trong môi trường Trypton.Fecal ColiformIII./ Đặc điểm sinh lý,sinh hóa của vi sinh vật:IV/ Phương pháp lấy mẫu và phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật1.1/ Phương pháp lấy mẫu:a/ Đặc điểm của mẫu:Mật độ của vsv trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm thường thấp hơn từ vài chục đến vài triệu lần so với trong bệnh phẩm và phân bố không đều trong mẫu.Trong quá trình xử lý nước vsv hiện diện thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống, do các biện pháp xử lý như lọc, khử trùng (clo, ozon, tia cực tím...).  vì vậy khi kiểm nghiệm nước ta cần có thêm bước phục hồi sức sống và tăng sinh chọn lọc nhằm gia mật độ tương đối của các vsv cần phát hiện, ức chế sự tăng sinh trưởng các vsv không mong muốn khác.IV/ Phương pháp lấy mẫu và phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật1.1/ Phương pháp lấy mẫu:b/ Phương pháp thu mẫu:Nguyên tắc thu mẫu: mẫu thu được có tính đại diện cho khối nước cần kiểm tra.Đối với nước mặt: mẫu nước được thu vào bình thủy tinh dung tích 100-1000ml đã khử trùng.Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần thiết liên quan đến mẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu)Mẫu nên được phân tích trong vòng 6h sau khi thu mẫu.Chuẩn bị mẫuDung dịch muối pepton SPW: hấp khử trùng và được cho vào các ống nghiệm vô trùng mỗi ống 9ml.Lấy 10ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 90ml dung dịch SPW đã khử trùng lắc đều.1.2/ Phân tích các chỉ tiêu vsvIV/ Phương pháp lấy mẫu và phân tích các chỉ tiêu vi sinh vậtMẫu gốc1ml9ml dd SPW1ml9ml dd SPW9ml dd SPW9ml dd SPW1ml1mlĐộ pha loãng101102103104Định lượng Coliforms, Coliforms phân, Coliforms chịu nhiệt, và E. coli bằng phương pháp MPN Nguyên tắc:- Đây là pp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau.- Thường lặp lại 3 lần ở 3 nồng độ bậc 10 liên tiếp.- Kết quả tra ở bảng MPN và nhân với hệ số pha loãng.Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth (LBS).Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL).Môi trường lỏng E. coli (EC).Canh Tryptone.Môi trường rắn Simmon Citrate Agar.DD muối peptone SPW.Thuốc thử Kovac’s.Canh MR-VP.Thuốc thử Methyl Red.Thuốc thử α-napthol.Môi trường và hóa chất:Cấy vào ống canh BGBL,ủ 37oC, 48hSố ống (+) ở mỗi độ pha loãngChuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2,10-3Chuyển 1ml dd trên vào ống 10ml canh LSB, mỗi ống nồng độ 3 ống lặp lại, ủ ở 37oC, 48hGhi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãngSố ống (+) ở mỗi độ pha loãngCấy vào ống canh EC,ủ ở 44,50C, 24hCấy lên thạch EMB, ủ ở 37oC, 24hColiformsColiforms chịu nhiệtChọn khuẩn lạc điển hình,cấyvào MT Tryptone, ủ ở44,5±0,2oC , 24hChọn khuẩn lạc điển hình,cấyvào Tryptone, MR-VP, SC CitrateThử nghiệm IndolThử nghiệm IMViCĐếm số ống MT EC(+)&IMVi(C++--)tra bảng MPNĐếm số ống MT EC(+) & Indol(+)tra bảng MPNColiforms phânE. coliQuy trình định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phânVà E.coli bằng pp MPNa/ Định lượng Coliforms:- Cấy 1ml dich đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB.- Thực hiện tương tự với mẫu pha loãng 10-2 và 10-3.- Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48h.Ghi nhận ống có sinh hơi (+). Cấy dịch mẫu từ các ống LSB dương tính (+) sang các ống chứa canh BGBL. Ủ 37oC ± 1oC trong 48h.Quy trình phân tích:Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.b/ Định lượng Cliforms chịu nhiệt:Dùng que cấy vòng, chuyển một vòng dịch từ ống LSB (+) sang môi trường EC.Ủ trong 44.5 ± 0,2oC trong 24h. Đếm các ống có sinh hơi (+), ở mỗi độ pha loãng.Quy trình phân tích:c/ Định lượng Coliforms phân:Cấy ria dịch dịch mẫu từ ống (+) trên môi trường EC sang môi trường EMB ủ 37oC trong 24h. khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Colifoms phân (E. coli giả định).Quy trình phân tích:- Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1ml cấy vào canh Tryptone, ủ ở 44,5 ± 0,2oC, trong 24h.Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm: ống có xuất hiện màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+).- Thực hiện cho tất cả các ống (+) trên môi trường EC.Ghi nhận các ống (+) trên môi trường tryptone tương ứng với mỗi độ pha loãng. Quy trình phân tích:c/ Định lượng Coliforms phân:d./ Định lượng E. coliThực hiện tương tự như trường hợp coliforms phân để tìm các khuẩn lạc E. coli giả định.Chọn các khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực thử nghiệm IMViC.Quy trình phân tích:(-) (+)Khuẩn lạc E. Coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ + - -) chính là E. coli.Quy trình phân tích:Thực hiện tương tự các ống (+) trong môi trường EC và tạo được được khuẩn lạc E. coli gỉa định trên môi trường EMB.- Ghi nhận số ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.Quy trình phân tích:Cách đọc kết quả:	Từ kết quả thu được ở các trường hợp trên, dùng bảng MPN thích hợp (Bảng 3*3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ VSV trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.Quy trình phân tích:Hệ thống MPN 15 ốngĐịnh lượng Coliforms, Coliform phân bằng pp đếm khuẩn lạc:Nguyên tắc: Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1oC trong 24-48h.Máy đếm khuẩn lạcĐịnh lượng Coliforms, Coliform phân bằng pp đếm khuẩn lạc: Nguyên tắc: 	Ngoài lactose mt chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram(+) & chất chỉ thị pH như neutral red, crystal violet. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên mt canh chọn lọc như BGBL. 	Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 44oC. Mật độ coliforms hay coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lê khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa. Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA).Violet Red Bile Agar (VRB).Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL).Môi trường canh EC Broth.Môi trường canh Trypton Broth.Thuốc thử Kovac’s hay Indol.Môi trường hóa chất:Chuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3Cấy 1ml dd mẫu vào đĩa petri, bổ sung 5ml MT TSA, lắc đều,Để yên 1-2hRót vào mỗi đĩa 10-15ml MT thạch VRB, để đông, ủ ở 37oCTrong 24-48hĐếm các khuẩn lạc màu đỏ đến màu đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥0,05mm, chọn 5 khuẩn lạc.Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở 37oC, 24-48hCấy vào ống canh EC, ủ ở 44oC, 24-48hĐếm số ống canh(+) (sinh hơi)Tính tỉ lệ khẳng định ColiformsChọn ống canh (+)(sinh hơi)Mật độ ColiformsCấy vào ống canh Trypton,MR-VP, thạch SC CitrateThử nghiệm IndolĐếm số ống mt EC(+)& Indol(+), tính tỉ lệ khẳng định Coliform phânThử nghiệm IMViCMật độ Coliforms phânĐếm số ống mt EC(+)&IMViC++--, tính tỉ lệ khẳng định E.coliMật độ E.coliQuy trình định lượng Coliforms, Coliforms phân, E.coli bằng pp đếm khuẩn lạcMẫu được đồng nhất hóa và pha loãng, sao cho chưa < 100 tế bào Coliforms trong 1ml dd pha loãng.Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu vào đĩa petri, Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45oC.Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần để trộn đều dd mẫu với mt. Để ở nhiệt độ phòng trong 1-2h để hồi phục các tế bào bị tổn thương.Bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml mt thạch VRB. Chờ cho mt trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37±1oC trong 24-48h.Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10-100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng.Quy trình phân tích:Thử nghiệm khẳng định Coliforms:- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa mt BGBL (trường hợp khẳng định Coliforms tổng số) hoặc mt EC (trường hợp khẳng định Coliform phân).Ủ các ống BGBL ở 37±1oC và các ống EC ở 44oC trong 24-48h.Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục MT & sinh hơi trong ống Durham.Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định.Trường hợp thử nghiệm khẳng định Coliform phân, các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC cần được thực hiện thử nghiệm Indol ở 44oC. Thử nghiệm khẳng định Coliform phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên mt EC vừa là (+) trên thử nghiệm Indol. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms và Coliform phân.Nn1vf1++nivfiA(CFU/g hay CFU/ml) =x RN: tổng số khuẩn lạc đếm đượcni: số đĩa có số khuẩn lạc được tuyển chọn tại mỗi độ pha loãngv: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩafi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếmR: tỉ lệ khẳng địnhCách tính kết quả:Định lượng E.coli bằng pp đếm khuẩn lạcNguyên tắc:	Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường có chứa lactose, ủ ở 44oC trong 24h, đếm các khuẩn lạc ó hình dạng đặc trưng của coliform. Khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng pp thử nghiệm IMViC.Môi trường và hóa chất:Môi trường Tryntone Soya Agar (TSA) và môi trường thạch Violet Red Bile Agar (VRB).Môi trường E.coli (EC)Môi trường Lactose tryptone Lauryl Sulphate Broth (LST Broth).Môi trường Tryptone Broth.Môi trường MR-VP Broth.Môi trường thạch Simmon Citrate.Thuốc thử Kovac’s.Quy trình phân tíchMẫu được đồng nhất, pha loãng và định lượng tương tự như phần Coliforms phân với các bước khẳng định được tiến hành như sau:Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy truyền sang môi trường EC ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h  chọn ống có sinh hơi (+).Cấy truyền sang các môi trường sau: Tryptone, MR-VP, thạch Simmon Citrate. Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h.Thực hiện thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận số khuẩn lạc có thử nghiệm khẳng định E.coli (+) (IMViC là ++--).Cách tính kết quảTính tỷ lệ khẳng định và tính mật độ E.coli (CFU/ml) theo công thức trên.Pha môi trường:Thành phầnKhối lượng(thể tích)1. Tryptose20g 2. Lactose5g3. Sodium chloride5g4. KH2PO42,75g5. K2HPO42,75g6. Lauryl sulphate 0,1g7. Nước cất1lMôi trường Lauryl Sulphate Broth:Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH môi trường là 6,8±0,2.Môi trường BGBL (Brilliant Green Bile Lactose Broth):Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Peptone10g2. Lactose 10g3. Brilliant green20g4. Nước cất1lRót vào mỗi ống nghiệm có chứa Durham 10 ml môi trường BGBL. Hấp ở 110oC trong 15 phút, pH 7,4.Môi trường EC:Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Trypticase hoặc tryptose20g2. Muối mật No.31,5g3. Lactose5g4. K2HPO44g5. KH2PO41,5g6. NaCl5g7. Nước cất1lRót môi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham. Hấp khử trung ở 1210C trong 15 phút, pH 6,9±0,2.Môi trường tryptone:Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Tryptone hoặc trypticase10g2. Nước cất1lHấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, pH 6,9±0,2.Môi trường MR-VP Broth:Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Bufered peptone-water powder (Difco hoặc BBL)7g2. Glucose5g3. K2HPO45g4. Nước cất1lMôi trường 1:Thành phầnKhối lượng( thể tích)1. Casein Pancreatic Digest3,5g2. Peptic digest of animal tissue3,5g3. Dextrose5g4. Potassium phosphate5g5. Nước cất1lHòa tan các thành phần trong nước. Phân phối 10ml vào các ống nghiệm và hấp vô trùng ở 118-121oC trong 15 phút, pH cuối 6,9±0,2.Môi trường 2:Môi trường MR-VP Broth:Thành phầnKhối lượng (thể tích)1. Peptone 5g2. Glucose5g3. Phosphate buffer5g4. Nước cất1lHòa tan các thành phần trong nước. Phân phối 10ml vào các ống nghiệm và hấp ở 121oC trong 15 phút , pH cuối 7,5±0,2.Môi trường 3:Môi trường MR-VP Broth:Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Sodium citrate2g2. NaCl5g3. K2HPO41g4. NH4H2PO41g5. MgSO40,2g6. Bromothymol blue0,08g7. Agar15g8. Nước cất1lĐun nóng nhẹ, thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1-2 phút. Đổ vào 1/3 ống nghiệm có nắp. Hấp ở 1210C, trong 15 phút, đặt nghiêng ống nghiệm, pH cuối 6,8±0,2.Môi trường TSA (Tryptone Soya Agar)Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Trypticase peptone15g2. Phytone peptone5g3. NaCl5g4. Agar 15g5. Nước cất1lĐun nóng để hòa tan agar, phân phối vào các erlen. Hấp khửTrùng 15p ở 121oC. pH cuối 7,3±0,2.Môi trường thạch VRB (Violet Bile Agar):Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Cao nấm men3g2. Peptone hoặc gelysate7g3. NaCl5g4. Muối mật1,5g5. Lactose 10g6. Neutral red0,03g7. Crystal violet0,002g8. Agar15g9. Nước cất1lHòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh về pH 7,4±0,2Đun sôi trong 2p, không hấp trùng. Sử dụng làm mt đổ đĩa.Môi trường LST Broth (Lactose Tryptone Lauryl sulphate broth)Thành phần Khối lượng( thể tích)1. Tryptose hoặc trypticase20g2. Lactose 5g3. NaCl5g4. K2HPO42,75g5. KH2PO42,75g6. Sodium lauryl sulfate0,1g7. Nước cất1lPhân phối mt vào các ống nghiệm có chứa ống Durham.Hấp khử trùng 15p ở 121oC, pH cuối 6,8±0,2.Thuốc thử Kovac’s:Thành phần Khối lượng( thể tích)1. p-Dimethylaminobenza aldehyde (p-DMABA)10g2. Isoamyl alcohol150ml3. HCl đặc40ml-Hòa tan p-DMABA trong dung môi, bổ sung và khuấy từng phần nhỏ HCl cho đến khi đủ lượng. -Thuốc thử được chứa trong chai màu tối tránh ánh sáng ở 4oC.Thuốc thử α-napthol:Thành phần Khối lượng( thể tích)1. α-napthol1g2. Acetic acid 5N200mlChuẩn bị acetic acid bằng cách cho 28,75ml acid glacial acetic vào 71,25ml nước cất vô trùng.Giữ dd trong chai thủy tinh tối màu.Thuốc thử methyl đỏ:Thành phầnKhối lượng( thể tích)1. Methyl red0,10g2. Ethanol300ml3. Nước cất (đủ)500mlHòa tan methyl đỏ vào 300ml ethanol. Thêm nước cất vào cho đủ thể tích 500ml.Chân thành cảm ơn Cô & các bạn đã theo dõiNhóm: WAO_OneVõ Lê Chi 50130120Lê Thị Ngọc Dung 50130219 (nhóm trưởng)Nguyễn Thị Diệu 50130205