Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào

À SINH TRƯỞNG THỰC VẬTLà các chất hữu cơ có bản chất hoá học khác nhau, được tổng hợp với một lượng nhỏ ở các cơ quan, bộ phận nhất định của cây và từ đấy được vận chuyển đến tất cả các cơ quan, bộ phận khác để điều tiết các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây và để đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận trong cơ thể.CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG THỰC VẬTLà những chất có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có tác dụng điều tiết quá trình sinht rưởng phát triển của cây.Phytohoocmon là các chất hữu cơ được tổng hợp với một lượng nhỏ ở các cơ quan, bộ phận khác nhau để điều tiêt các hoạt động sinh lí, quá trình sinh trưởng, phát triển.Nhóm AuxinNhóm cytokininNhóm GibberelinAcid absicic. EtylenAUXINAuxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indol axetic axit (IAA)Các Auxin nhân tạo: NAA (napthyl axetic acid), 2,4-D (diclophenoxy axetic acid)Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn. Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồiAuxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô. Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus) Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)1. Nhóm AuxinBao gồm: IAA, NAA, 2,4 –D, IBA. Nhóm chất này có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự phát sinh hình thái và kích thích sự tạo rễ ban đầu.2,4-D cảm ứng sự tạo mô sẹo. Tạo phôi somaNAA, IAA, IBA kích thích sự tạo rễ.Nồng độ sử dụng: 0,1 – 10mg/lChú ý: IAA, IBA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân huỷ trong quá trình hấp tiệt trùngcác auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng CYTOKININLà các dẫn xuất của các adenineCác cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6---dimethyl-aminopurine (2-iP), zeatinCó tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào và làm hạn chế sự hoá già của tế bào, phân hóa chồi trong nuôi cấy môNgoài ra còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym.Chức năng của nhóm CYTOKININKích thích phân chia tế bào Tạo và nhân callus Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào - Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế sự hình thành rễ - Ức chế sự kéo dài chồi - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục Nhóm cytokininNhóm này khi phối hợp cùng với auxin thì kích thích sự phân chia tế bào và sự phát sinh hình thái, kích thích chồi ngọn và chồi bên phát triển.Bền với nhiệt, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. 3. Nhóm Gibberilin (GA)do loài nấm Gibberella fujikuroi Loại thông dụng dùng trong nuôi cấy mô GA3. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính Kìm hãm sự tăng trưởng của mô sẹo nên ít sử dụng trong nuôi cấy TB, tuy nhiên người ta vẫn sử dụng vào việc nghiên cứu sự phát sinh hình thái.Gibberellin có các chức năng Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit. Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch. Ức chế sự hình thành rễ bất định Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ) Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt 4. Acid Asbcicic (ABA)ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng. Trong nuôi cấy mô và tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vât do vậy được sử dụng trong việc nuôi cấy phôi.Cách pha môi trườngPha loãng các muối khoáng, điều chỉnh thể tíchĐo pH, thường chỉnh pH 5,5 – 5,8Thêm đường, thêm agar, khuấy đều.Đung nóng môi trường cho sôi hoàn toàn đến khi aga hoà tan và môi trường có dạng trong suốt. Thêm các vitamin, các chất ĐHST và các chất khác.Lắc đều môi trườngPhân phối môi trường vào các bình thuỷ tinh nuôi cấyKhử trùng môi trường pH môi trườngĐộ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0-6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu. Nhìn chung nếu độ PH cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn 5 thì agar khó đông. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào.Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc. Phương pháp nuôi cấy: Nuôi cấy trên môi trường đặcNuôi cấy trên môi trường lỏng Nuôi cấy trên môi trường đặcDùng môi trường đặc để nuôi cấy cơ quan tách rời, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy bao phấn. ưu điểm: dễ thao tác và vận chuyển đi xa.Nhược điểm: mẫu chỉ tiếp xúc được một mặt với mt dinh dưỡng, đồng thời những sản phẩm do mẫu tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ bị tích tụ làm chậm sinh trưởng của mẫu.Nuôi cấy trên môi trường lỏngNuôi cấy lỏng khuấy: mẫu đc ngâm một phần hay ngập hoàn toàn trong dung dịch của môi trường. Các bình chứa mẫu được đặt trên máy lắc với tốc độ 100 – 120 vòng/ phút tạo đk cho sự trao đổi khí. Dùng trong trường hợp nuôi cấy tế bào đơn, huyền phù tế bào, nuôi cấy để sản xuất các chất thứNuôi cấy lỏng tĩnh: Bình nuôi cấy đc để nguyên trong mt, mẫu có một phần ngâm trong dung dịch của mt và phần kia tiếp xúc với không khí.Ngoài ra mẫu có thể nuôi trên mt bán lỏng, bán rắn, hoặc phối hợp cả 2 loại mt. Lựa chọn mt nào là tùy thuộc vào đối tượng, giai đoạn phát triển của mẫu, mục đích của kỹ thuật nuôi cấy Nuôi cấy trên môi trường lỏngSƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO Vi nhân giốngTạo giống mới.Bảo quản giốngVi nhân giống nhân giống invitro) Thuật ngữ nhân giống in vitro(invitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở đk vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các bình nuôi cấy khác nhau.Ưu và nhược điểm của vi nhân giống  Ưu điểm- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn:- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao- Sản phẩm cây giống đồng nhất:- Tiết kiệm không gian- Nâng cao chất lượng cây giống:- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn:- Lợi thế về vận chuyển:- Sản xuất quanh năm- Hạn chế: về chủng loại sản phẩm- Chi phí sản xuất cao- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình Các giai đoạn của quá trình vi nhân giốngChuẩn bị cây mẹ:Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng Nhân nhanh chồi Tạo rễ invitroChuyển cây ra đất trồng Giai đoạn chuẩn bị cây mẹChọn cây mẹ để lấy mẫu: khỏe, có gía trị kinh tế caoChọn cơ quan để lấy mẫu: chồi ngọn, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non...Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùngKhử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị mt nuôi cấyCấy mầu vô trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi (gọi là gđ cấy mẫu in vitro)Các mẫu nuôi cấy nếu ko bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus được lưu giữ trong phòng nuôi với đk nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau 1 thòi gian nhất định mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện cac cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính. Gđ này yêu cầu từ 2 – 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy truyềnDo vậy nên chọn ĐST , chồi nách, sau đó đọan thân, mảnh lá....để nuôi cấy Nhân nhanh chồiThành phần và đk môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích này.Quy trình cầy truyền để nhân nhanh chồi 1 2 tháng tùy loại câyHệ số nhân nhanh 2- 8 lần/ 1 lần cấy truyền.Gđ này kéo dài khoảng 10 – 36 tháng và ko nên quá lâu để tránh biến dị somaNhân nhanh chồiGiai đoạn ra rễ invitroTách các cụm chồi và chuyển sang môi trường ra rễ. Để trở thành cây con hòn chỉnh. Giai đoạn này kéo dài 2 – 4 tuần.Bổ sung auxin vào môi trường để cảm ứng sự ra rễ: IAA (0,1 – 10mg/l); NAA (0.05 – 1,0mg/l); IBA (0,5 – 3,0mg/l)Quá trình ra rễ là quá trình hố hấp mạnh đòi hỏi nguồn carbohydrate cung cấp từ quang hợp và môi trường nuôi cấy (George, 1993). Do vậy, tăng hàm lượng đường hoặc ánh sáng giúp cây ra rễ tốt hơn. Giai đoạn vườn ươmGiai đoạn ra nhà lưới rất quan trọng vì chuyển cây từ ống nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên. Giai đoạn vườn ươmGiai đoạn vườn ươm Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ ẩm và làm mát Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển. Giai đoạn 5 thường đòi hỏi 4 - 16 tuần Các phương pháp nhân giống invitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởngNhân giống thông qua giai đoạn callus Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính 4. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.1. Đỉnh sinh trưởngĐỉnh sinh trưởngĐỉnh sinh trưởngỞ thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu từ trong mô phân sinh ngọn – đỉnh sinh trưởng.Quá trình tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong tế bào của đỉnh sinh trưởng. Đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch vi rút. Sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để thu được cây sạch bệnh gây ra bởi nấm và vi khuẩn.Tách đỉnh sinh trưởngĐST thường được tách với kích thước 5- 10 mm: toàn bộ mô phân sinh đỉnh và một phần mô xung quanh. Phương phápMô phân sinh chồi ngọn hoặc chồi bên đc bảo vệ triệt để bởi các lá đang phát triển và các vảy bắc nên việc khử nhiễm gàn như ko cần thiết. Để khử trùng nhẹ bè mặt, các chồi và các đoạn tha đã đc cắt bỏ lá đc rử trong khoảng vài giây trong cồn 96%, sau đó đươc ngâm trong dung dịch Canxi hypoclorit 50g/l, trong 10 – 20 phút và rử nhẹ vài lần bằng nước cất vô trùng.+ Một tay dùng panhk giữ chồi dưới KHV, một tay cấm kim/ dao ấn nhẹ để cắt bỏ các lá non và sơ khởi lá. Sau đó dùng dao để cắt rời phàn ĐST lộ ra có hình đỉnh tròn, sáng bóng.+ ĐST được chuyển sang mt dinh dưỡng.+ Một ĐST nuôi cấy ở đk thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh2 phương thức phát triển cây từ nuôi cấy ĐST: Phát triển cây trực tiếp Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm Phát triển cây trực tiếpĐỉnh sinh trưởng  Chồi nách  CâyA. Mầm khoai tâyB. Sự kéo dài của mầm khoai tây trong nuôi cấyPhát triển cây thông qua giai đoạn protocorm Đỉnh sinh trưởng  Protocorm  Cây2. Phương pháp nuôi cấy nốt đơn thânMẫu cấy: chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Đoạn chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo cây nguyên vẹnChồi thu được ở các nách lá, sau đó cấy trên môi trường dinh dữơng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởngnuôi cấy chồi bất địnhA. Chồi bất địnhB. Tái sinh cây từ chồi bất địnhNhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹoNếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây thu dược cũng khá đồng nhất về mặt di truyền.Tuy nhiên trong một số trường hợp mô nuôi cấy khôpng thể tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô được gọi là mô sẹo. Sau đó khối mô sẹo này được cấy chuyền nhiều lần khi cần tái sinh thành cơ quan. Nuôi cấy mô sẹoMô sẹo là khối tế bào không có tổ chức được hình thành từ các mô và cơ quan đã biệt hoá dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, các chất ĐHSTTV).Người ta thấy rằng, các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này chịu một sự phản biệt hoá trước lần phân chia đầu tiên trong môi trường mới.Sự phản biệt hoá này đóng vai trò quan trọng vì nó cho phép tế bào trưởng thành trở về trạng thái non trẻ.Sự biệt hoá và phản biệt hoáBiệt hoá là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó.Phản biệt hoá: các tế bào dùng trong nuôi cấy đều là các tế bào biệt hoá, trong một số điều kiện thích hợp có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó được gọi là sự phản biệt hoá. Sự cảm ứng tạo mô sẹoMẫu cấy ban đầu được khử trùng và cắt thành nhiều mảnh rồi nuôi trên môi trường đặc. Ở đây có sự phản biệt hoá của các tế bào đem nuôi cấy. Sau khi phản biệt hoá các tế bào phân chia dưới ảnh hưởng của các chất ĐHSTTV trong môi trường nuôi cấy. Sự phân chia này tạo nên khôi mô và được gọi là mô sẹo – callus. Tất cả các loại cơ quan (rễ, thân, lá, hoa) và mô thực vật đều có thể dùng làm nguyên liệu để tạo mô sẹo.Nuôi cấy mô sẹoNguyên liệu tạo mô sẹo được đưa vào nuôi cấy trên môi trường đặc và cần thiết phải bổ sung Auxin.Trong quá trình nuôi cấy tạo mô sẹo, mẫu thường để trong tối.Từ các khối mô sẹo có thể đưa vào môi trường nhân sinh khối để thu lượng lớn mô sẹo.Sau đó mô sẹo được cấy trên đặc khi muốn tái sinh thành cơ quan và cấy trên môi trường lỏng khi muốn tái sinh thành phôiNhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹoA. Mô sẹoB. Tái sinh chồi từ mô sẹoNhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹoMô sẹo cây tỏi sau 2 tuần nuôi cấyB. Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấyC. Tạo chồi từ mô sẹoD. Cây tái sinh từ mô sẹoE. Củ tỏi thu được từ cây con nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹoỨng dụng của việc nuôi cấy mô sẹoNhân giống invitro ở những loài TV mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng không thực hiện đượcLàm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học.Làm nguyên liệu cho chọn dòng tế bào.Nghiên cứu quá trình hình thành các cơ quan. Vi nhân giống cây cà phêNhân giống thông qua việc tạo phôi vô tínhTạo phôiNhân phôiPhát triển và trưởng thành phôiNảy mầm của phôiThuần hoá cây con in vitrophôi hữu tínhĐược hình thành và phát triển từ những tế bào sinh dục : sau khi sự thụ tinh đôi xảy ra: một tinh trùng thụ tinh với trứng và thành lập hợp tử lưỡng bội, một loạt các phân cắt đẳng nhiễm xảy ra, hợp tử phát triển thành phôi phôi hữu tính có cấu trúc 2 cực: cực rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ và ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo cây hoàn chỉnh.Phôi phát triển từ hợp tử: Sự phân bào đẳng nhiễm theo phương ngang chia hợp tử thành một tế bào đầu và một tế bào cuối.Tế bào đầu tiếp tục phân chia theo chiều ngang tạo nên dây treo có chức năng cố định phôi và chuyển chất dinh dưỡng từ cây mẹ sang.Tế bào cuối phân chia nhiều lần tạo tiền phôi dạng cầu, dạng trái tim và cuối cùng là dạng cá đuối.Noãn sau thụ tinh có chứa nhân tam bội và phôi.Phôi vô tínhPhôi soma: Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình qua đó một hay vài tế bào soma, trong các đk thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất ĐHSTTV), có thể dấn thân vào sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hay gần giống với phôi hợp tửPhôi vô tínhPhôi vô tính là phôi được hình thành và phát triển từ các tế bào dinh dưỡng , mà các tế bào này có thể phân hóa thành những cấu trúc lưỡng cực, một cực hình thành rễ còn một cực tạo ra chồi, giống như phôi hợp tử.  Sự phát sinh phôi vô tính con đường phát sinh phôi trực tiếp: được hình thành từ các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi, con đường gián tiếp: thông qua quá trình tạo mô sẹo.Đặc điểm của những tế bào có khả năng tạo phôiLà những tế bào nhân to, tế bào chất đậm đặc nhiều hạt tinh bột lớnhàm lượng Protein và RNA cao, Có hạch nhân khá lớn ăn màu phẩm nhuộm đậm. Các giai đoạn phát triển của phôiMỗi tế bào phôi soma đều phát triển qua 3 giai đoạn trước khi trưởng thành: hình cầu, hình trái tim, hình cá đuốiCác giai đoạn của sự phát triển phôi vô tínhSự tạo phôi vô tínhCó 2 sự kiện quan trọng quyết định liên quan đến chương trình sớm của quá trình phát triển:- Cảm ứng biệt hóa tế bào của những tế bào tiền phôi .- Biểu hiện trình tự phát triển ở các tế bào tiền phôi. Qua nghiên cứu về những biểu hiện bất thường trong quá trình phát triển phôi soma là do sự mất cân đối của các chất trong môi trường nuôi cấy.Môi trường khởi đầu cho sự hình thành các tế bào phôi cần AuxinSự tạo phôi vô tínhPhát sinh phôi từ tế bào soma , trải qua 2 giai đoạn :- Mô thực vật được nuôi cấy trên môi trường có mặt của auxin để phát sinh tế bào soma. Khối tế bào soma tăng sinh nhanh theo hướng phản biệt hóa và manh tính hữu cực .- Khối tế bào soma được đưa vào môi trường nuôi cấy trên môi trường giảm hẳn hay không có auxin hay có bổ sung cytokinin , tế bào soma được kích thích để đi vào giai đoạn biệt hóa thành phôi soma . Các bước nuôi cấyChọn mẫu cấyKhử trùng mẫuMôi trường nuôi cấy phôiĐiều kiện nuôi cấy phôi Duy trì quá trình phát sinh phôi đồng nhất.Tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi soma Chọn mẫu cấyMẫu có thể là :- Tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành - Những tế bào ở những mô có quan hệ với sự sinh sản: hạt phấn, chồi mầm Môi trường nuôi cấy phôiChất vô cơNguồn carbonNguồn NitrogenCác chất hữu cơ và dịch chiết khácChất điều hòa sinh trưởngGiá thểThan hoạt tínhpH môi trườngThiết lập hệ thống phát sinh phôi đồng nhất và hiệu suất cao Tạo dịch huyền phù tế bào :chọn lọc những cụm tế bào to (bằng cách ly tâm) và được cấy chuyển sang môi trường không có auxin. Một hệ thống được yêu cầu là có tần suất phát sinh phôi cao từ những tế bào đơn. Ưu điểm của nhân giống bằng phôi vô tínhHệ số nhân giống cao:Ví dụ, ở cà phê người ta có thể tạo được 600.000 phôi vô tính từ 1 gram sinh khối ban đầu trong vài tháng với tỷ lệ tái sinh cây từ phôi vô tính đạt 47% Phôi vô tính chứa một lượng chất dinh dưỡng tương tự với nội nhũ của phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh, do vậy có thể nảy mầm trực tiếp thành cây Phôi vô tính sau khi tạo hạt nhân tạo có thể bảo quản và lưu giữ dài hạn. -Khả năng công nghiệp hoá và tự động hoá quá trình nhân giống quy mô lớn, đặc biệt là nhân giống bằng bioreactor Những đặc tính cơ bản của cây từ phôi vô tính Giống cây mẹ ban đầu về mặt di truyền và các đặc tính nông học khác. Phôi vô tính bảo tồn mọi đặc tính ưu thế lai của cây mẹ nếu mẹ có ưu thế lai cao. cây từ phôi vô tính gần như sạch bệnh hoàn toàn ứng dụng của việc tạo phôi vô tính- Hạt giống nhân tạoVề cơ bản giống như hạt giống tự nhiên, có cấu tạo là phôi được bao bọc bởi lớp áo bên ngoài. Có khả năng nảy mầm giống như hạt giống trong tự nhiênĐiểm khác biệt là hạt giống nhân tạo không có nôi nhũ. hạt nhân tạo có thể là chồi mầm, chồi đỉnh, đốt lá, củ siêu nhỏ, protocorm (ở phong lan) được bọc bằng màng nhân tạo với khả năng lưu giữ, bảo quản và nảy mầm thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện thích hợp. Vỏ bọc hạt nhân tạoPhải có đặc điểm là có thể cung cấp dinh dưỡng khoáng, chất ĐHSTTV, và cacbonhydrat để thúc đẩy sự tăng trưởng của phôi trong quá trình nảy mầm và giúp cho phôi có tỷ lệ sống cao. Các chất để tạo vỏ bọc phôi được chiết xuất từ rong biển (agar, caragreenan, alginate),kết quả cho thấy chỉ có chất alginat là thích hợp nhất.Hạt nhân tạoNuôi cấy phôiNuôi cấy phôi non: Kiểu nuôi cấy này được dùng chủ yếu cho các phôi non có nguồn gốc từ các hạt lai hoặc hạt non không thể nảy mầm Nuôi cấy phôi trưởng thành: Các phôi trưởng thành được tách ra từ các hạt chín và nuôi cấy Kỹ thuật nuôi cấy phôiKhử trùng bề mặtPhân lập phôi: giải phẫu hạt, Ngâm hạt có vỏ cứng trong nước từ một vài giờ đến một vài ngày trước khi khử trùng để giải phẩu nó được dễ dàng hơn Môi trường dinh dưỡng Nhu cầu dinh dưỡng của phôi trong quá trình phát triển in vivo chia làm hai pha: pha dị dưỡng (heterotrophic phase)-pha sớm, ở pha này phôi nhận chất dinh dưỡng từ nội nhũ.pha tự dưỡng (autotrophic phase)-pha muộn, ở pha này phôi có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho sinh trưởng của chúng. Môi trường dinh dưỡngMuối khoáng:Nguồn carbon: các nồng độ khác nhau của sucrose dùng trong nuôi cấy phôi phụ thuộc vào loa