Kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi in vitro - Công nghệ tế bào trong bảo quản nguồn gen

Kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi in vitro.Công nghệ tế bào trong bảo quản nguồn genSinh viên thực hiệnTrương Thị AnhNguyễn Thị HạnhĐặng Thị LuyếnNguyễn Thị ThúyTrịnh Văn VượngCông nghệ sinh học nông nghiệpI. MỞ ĐẦUTrong chọn giống, yếu tố quyết định thành công là tìm được những biến dị mới có lợi. Một trong những phương pháp sử dụng phổ biến và rộng rãi là phương pháp lai hữu tính đặc biệt là lai xa. Tuy nhiên thực tế cho thấy hiện tượng bất hợp trong lai xa thường xảy ra ngăn cản quá trình thụ phấn thụ tinh của cây. Để khắc phục hiện tượng trên người ta sử dụng thụ phấn trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi invitro.Để tìm ra biến dị có lợi điều kiện tiên quyết phải có nguồn vật liệu. Do đó, công việc bảo quản nguồn gen thực vật là công việc không thể thiếu trong công tác giốngPhương thức bảo quản invitro có vai trò quan trọng vì bảo quản trong không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ khối lượng lớn cá thể trong điều kiện hoàn toàn chủ động.II NỘI DUNG2.1. Hiện tượng tự bất hợp trong lai xa.2.2. Kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm. 2.2.1. Phương pháp thụ phấn in vitro. 2.2.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro. 2.2.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro.2.3. Nuôi cấy phôi in vitro. 2.3.1. Phôi. 2.3.2 Phân loại. 2.3.3 Kỹ thuật.2.4. Công nghệ tế bào trong bảo quản nguồn gen. 2.1. Hiện tượng tự bất hợp trong lai xa. Bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh. - Hạt phấn không nảy mầm trên đầu nhụy của cây mẹ do núm nhụy tiết ra một chất ức chế sự phát triển của ống phấn hoặc làm biến dạng ống phấn - Ống phấn phát triển rất chậm hoặc vòi nhụy quá dài, hạn chế khả năng đưa tinh trùng đến túi phôi để thụ tinh. - Tính không phù hợp di truyền giữa giao tử đực và giao tử cái, thụ tinh không xảy ra. Bất hợp của giao tử sau khi thụ tinh. 	Bao gồm các hiện tượng: thui phôi, phôi bị ngừng phát triển ở giai đoạn nào đó mà chưa đạt tới giai đoạn trưởng thành, nội nhũ phát triển không hoàn chỉnh, cây lại có sức sống yếu, bất dục Nguyên nhân có thể là do: - Hiện tượng không dung hợp về bộ nhiễm sắc thể của hai loài - Thể lai có bộ nhiễm sắc thể không cân đối - Tính không hòa hợp về mối quan hệ giữa nhân và bào chất của hai loài, hoặc tính không hòa hợp giữa nội nhũ và phôi.2.2. Kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệmThuật ngữ chung “thụ phấn in vitro” được dùng cho:Thụ phấn noãn (ovular pollination)Thụ phấn bầu quả (ovarian pollination) Thụ phấn giá noãn (placental pollination)Thụ phấn núm nhụy (stigmatic pollination) Thụ phấn trong ống nghiệm nghĩa là thực hiện quá trình tạo hợp tử không phụ thuộc vào cơ thể mẹ,bao gồm các bước sau: 	- Kích thích hạt phấn nảy mầm. 	- Kích thích sinh trưởng ống phấn. 	- Nuôi noãn và thụ tinh noãn. 	- Nuôi hợp tử thành hạt. 2.2.1. Phương pháp thụ phấn in vitro  Nguyên liệu Các bầu quả (ovaries) có nhiều noãn (ovules) là nguyên liệu thực nghiệm tốt nhất. Hạt phấn (pollen). - Sự nảy mầm của hạt phấn in vitro có thể gặp khó khăn ở một số họ nhưng có thể khắc phục bằng cách ngâm noãn (ví dụ: Brassica oleracea) một ngày trước khi thụ phấn trong CaCl2 1% là nhân tố thích hợp cho sinh trưởng của ống phấn. Khử trùng nguyên liệu Các nhụy hoa (pistils) sau khi loại bỏ đài và tràng hoa, hoặc các bầu quả riêng rẽ, rửa nhanh với EtOH 70%, khử trùng bề mặt bằng các tác nhân thích hợp, và cuối cùng rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Bầu quả sau đó được bóc vỏ cẩn thận bằng dao mổ hoặc kim, để lộ phần noãn gắn vào giá noãn. Giá noãn hoàn toàn, hoặc một phần của nó có mang noãn, được dùng trong thụ phấn giá noãn. Để thực hiện thụ phấn núm nhụy in vitro, các nhụy được tách rời và khử trùng cẩn thận bề mặt bằng dung dịch khử trùng và sau đó thấm khô núm nhụy. Phân lập hạt phấn ở điều kiện vô trùng, bao phấn được loại bỏ khỏi nụ hoa hoặc các hoa đã mở được giữ trong các đĩa petri có giấy lọc vô trùng cho tới khi nứt ra, các hạt phấn sau đó được đặt trong các noãn nuôi cấy, giá noãn hoặc núm nhụy tùy thuộc vào bản chất thí nghiệm. Nuôi cấy noãn và bầu quả Noãn: Sinh trưởng của ống phấn gắn trên noãn trần (bare ovules) thường bị ức chế bởi sự có mặt của nước trên bề mặt của noãn. Màng nước này phải được làm khô bằng giấy lọc và sau đó noãn khô ráo được phủ bằng hạt phấn.Các dạng mô sẹo thu được từ nuôi cấy mô noãn sau thụ phấn từ 1 đến 8 tuần tuổi ở cam.Các bước phát triển của noãn cây hoa hướng dương sau nuôi cấy.Bầu quả: Nuôi bầu quả tách từ các hoa thụ phấn in vitro để phát triển thành quả chín. Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng và bổ sung vitamin B, IAA hoặc nước dừa vào môi trường giúp quả đạt kích thước bình thường ,các hạt có thể nảy mầm được. 2.2.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro.Trạng thái sinh lý của mẫu vật. Bề mặt noãn hoặc núm nhụy (trong thụ phấn núm nhụy) ẩm ướt có thể ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt phấn hoặc phát triển của ống phấn và tiếp theo đó là hình thành hạt kém. Sự nảy mầm của hạt phấn trên núm nhụy và sự sinh trưởng của ống phấn dọc theo vòi nhụy có ảnh hưởng đến sự tổng hợp các protein, là các nhân tố đôi khi có thể ức chế hoàn toàn ống phấn trong bầu quả. Thời gian tách noãn khỏi nhụy ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro.Môi trường nuôi cấyMuối khoáng: Na, K, CaNồng độ đườngAmino acid: glutamine, alanine, arginine, asparticCác chất điều tiết sinh trưởng: auxin, xytokinin, gibberellin Điều kiện nuôi cấy Nói chung, nhiệt độ và ánh sáng có ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh trong ống nghiệm. Thông thường bước một của quá trình này xảy ra ở nhiệt độ phòng và không cần sự chiếu sáng đặc biệt. Chỉ ở giai đoạn sau, nuôi cấy bầu quả cần được duy trì ở 22-260C và các điều kiện thích hợp khác có lợi cho phát sinh phôi. Sau khi thụ phấn trong ống nghiệm một vài ngày, một số noãn mở rộng, và ống phấn chui hoàn toàn vào trong túi phôi, cả phôi lẫn nội nhũ đều phát triển Kiểu gen Phản ứng của bầu quả in vitro trong mối liên quan với sự hình thành hạt tùy thuộc vào từng loài. Ví dụ: Hạt phấn của các loài họ cải khó nảy mầm trong nuôi cấy và người ta phải cải tiến kỹ thuật nuôi cấy cho phù hợp bằng cách nhúng noãn của Brassica oleracea trong dung dịch CaCl2 1%, sau đó gieo chúng trên một lớp gelatin 10% mỏng (10 µm) rồi thụ phấn với hạt phấn. Lớp gelatin mỏng được bảo quản trong đĩa petri có phủ giấy lọc gắn vào nắp hộp. Sau 24 giờ nuôi, noãn được thụ tinh và chuyển lên môi trường Nitsch có agar cho tới khi tạo hạt. 2.2.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro Được ứng dụng ít nhất ở 3 lĩnh vực: 	+ Khắc phục sự tự bất hợp (self-in compability)	+ Khắc phục sự bất hợp khi lai (cross-in compability) của các giao tử	+ Sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản (parthenogenesis).Nuôi cấy thành công các noãn được thụ phấn in vitro đã tăng khả năng sản xuất các thể lai. Lai cùng loài (intraspecific), khác loài (interspecific), khác chi (intergeneric) và khác họ (interfamilia) cũng đã được tiến hành thông qua sự thụ phấn giá noãn và noãn in vitro.2.3. Nuôi cấy phôi in vitro.2.3.1. Phôi. Gồm phôi hữu tính và phôi vô tính( phôi sôma).Phôi hữu tính: - Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử.- Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi.- Nuôi cấy phôi hữu tính chính là kỹ thuật cứu phôi.Phôi soma: Phát triển từ những tế bào sinh dưỡng. Vai trò giống như 1 hợp tử, có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh.Đều phát triển qua 3 giai đoạn trước khi trưởng thành: - Hình cầu - Hình tim - Hình thủy lôiSâm ngọc linhHình cầuHình tim	Hình thủy lôi2.3.2. Phân loại Nuôi cấy phôi non: Sử dụng chủ yếu cho các phôi non có nguồn gốc từ hạt lai hoặc hạt non không thể nảy mầm. Tách phôi rất khó khăn, môi trường nuôi cấy phức tạp. Khả năng thành công phụ thuộc giai đoạn phát triển phôi phân lập. Nuôi cấy phôi trưởng thành: Phôi tách từ hạt chín, Đơn giản, dễ làm, môi trường nuôi cấy đơn giản. Cần thiết phải thụ phấn nhân tạo để thu phôi ở tuổi đặc biệt.2.3.3 Kỹ thuật Khử trùng bề mặt. Phân lập phôi. Môi trường dinh dưỡng. Khó khăn trong nuôi cấy phôi và cách khắc phục. Khử trùng bề mặt. Thường dùng các dung dịch khử trùng thông thường như Ca-hypochlorite , Na-hypochlorite, HgCl2, Ngoài ra người ta còn dụng thêm các chất hoạt động bề mặt như Tween 80 , teepol , mannoxol để tăng tính thấm của mô. Với phôi tách rời và hạt ngô, ngâm trong EtOH 70% cộng với khử trùng bằng sodium hypochlorite 2.6% trong 5-10 phút. Phân lập phôi.Một số loài phôi có kích thước lớn, thuận tiện cho quá trình tách phôi (cây họ đậu), một số loài hoa khó tách phôi (hoa lan_hạt có kích thước nhỏ, vỏ hạt tiêu giảm và thiếu nội nhũ).Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thường xếp ở đỉnh của chùm hoa.Phải thực hiện trong điều kiện vô trùng dưới laminar.Phôi trưởng thành: phân lập bằng giải phẫu hạt, ngâm hạt vào nước trước vài giờ đến 1 vài ngày, tùy khả năng thấm nước của hạt.Phôi non: thao tác giải phẫu phải cẩn thận, tránh gây tổn thương Môi trường dinh dưỡng.- Pha dị dưỡng: phôi lấy dinh dưỡng từ nội nhũ.- Pha tự dưỡng: phôi có thể tự tổng hợp dinh dưỡng.- Thành phần môi trường của 2 loại phôi non và phôi trưởng thành là khác nhau.Thành phần: Muối khoáng: cung cấp chất khoáng.Đường: tác dụng cung cấp năng lượng cho phôi. Nguồn: từ glucose, sucrose, ngoài ra với ngô có thể bổ sung maltose, lactose.Nồng độ sucrose có thể dùng từ 0.5% đến 18%.Glucose và sucrose ngoài vai trò dinh dưỡng, còn có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường Phôi non yêu cầu nồng độ carbon hydrate cao hơn phôi trưởng thành.Nitrogen: KN03, NaN03, (NH4)2HPO4.Dịch chiết thực vật tự nhiên: bổ sung vào môi trường nước dừa, dịch chiết cà chua, dịch chiết quả chà làChất điều tiết sinh trưởng: dùng GA ở nồng độ thấp, auxin và cytokinin ít được sử dụng.PH môi trường: 5.0-7.5 là phù hợp.- Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25±20C là phù hợp.Ánh sáng: tùy đặc điểm của từng loại phôi, vd: phôi sơ cấp hình tim của loài ILex mẫn cảm ánh sáng, phôi thứ cấp lại sinh trưởng tốt ở đk chiếu sáng 4000lux trong 4 giờ/4 ngày nuôi đầu tiên. Khó khăn trong nuôi cấy phôi và khắc phục.Môi trường dinh dưỡng không phù hợp: Hiện nay các môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nuôi cấy đều có áp suất thẩm thấu thấp hơn dịch noãn, rất có thể không phù hợp.Khắc phục: sử dụng dịch chiết xuất từ nội nhũ.Tạo calus: do tương tác phôi-môi trường khác tương tác phôi-nội nhũ, sinh ra calus không ổn định về mặt di truyền.Thành tựu nuôi cấy phôi chè lai.Môi trường ½ MS + 2 GA3 + 50 đường + 6g aga tạo chồi tốt cho phôi chè lai Thành tựu: NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO PHÔI HOÁ VÀ PHÔI VÔ TÍNH TỪ NUÔI CẤY NOÃN Ở MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚITheo kết quả nghiên cứu nuôi cấy bầu nhuỵ và noãn ở quả non của một số giống citrus thì môi trường MT (Murashige & Tucker) là môi trường thích hợp nhất cho tạo callus phôi hoá (Đỗ Năng Vịnh, 2002).+Môi trường tạo callus phôi hoá: - MT + các nồng độ khác nhau của Kinetine: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 ( mg/l) + 500mg/l Malt extract + 50g/l đường + 5,0g/l 	thạch.- MT + các nồng độ khác nhau của BAP: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 (mg/l) + 500mg/l Malt extract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch.+ Môi trường lỏng lắc nhân sinh khối callus phôi hoá: MT + BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) + 30g/l đường + 500mg/l Malt extract + 1,0g/l glutamin.+ Môi trường tạo phôi: • G1: MT + 1,0mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch• G2: MT + 1,5mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch• BG: MT + 1,0mg/l GA3 + 0,2mg/l BAP + 5,0g/l thạch+ Môi trường nẩy mầm phôi vô tính: MS hoặc MT + 30g/l đường, không có chất điều hoà sinh trưởng. 	Môi trường được chỉnh đến pH= 5,8. Noãn được nuôi trên đĩa petri (15mm dày x 60mm đường kính) chứa 12 ml môi trường thạch, để trong tối.Nhân mô sẹo phôi hoá: mô sẹo được nhân trên môi trường đặc (thời gian 1tháng), sau đó chuyển sang môi trường lỏng ( 2 tuần ) rồi lại nhân tiếp trên môi trường đặc. Nhân mô sẹo trong tối ở nhiệt độ (25 – 270C). Quá trình phôi hoá của mô sẹo và nảy mầm của phôi xảy ra trong điều kiện có chiếu sáng 2400 Lux và thời gian chiếu sáng là 8 h/ngày. sự nảy mầm của phôi vô tính 2.4. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TRONG BẢO QUẢN NGUỒN GENCó hai phương thức bảo quản nguồn gen cây trồng:	Bảo quản Insitu: bảo quản trong điều kiện sinh thái tự nhiên.	Bảo quản Ex-situ: trên vườn ươm, bảo quản hạt trong kho lạnh, bảo quản in vitro2.4.1. Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểuPhương pháp này áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn các cây nhân giống in vitro.Đặc điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển nhờ ức chế sự sinh trưởng của mẫu cấy để giảm đến mức tối thiểu chi phí trong quá trình bảo quản.Mẫu bảo quản: phôi, chồi, mầm, cây con đã được làm sạch bệnh.Các nhân tố dùng để ức chế sinh trưởng:+ giảm nhiệt độ phòng nuôi.+ bổ sung vào môi trường các chất ức chế sinh trưởng, các chất làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường. Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản, mẫu cần được chuyển sang điều kiện tối thích một thời gian ngắn để kích thích sự tái sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu một chu kỳ bảo quản mới.SƠ ĐỒ LƯU GIỮ BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO (Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật)2.4.2. Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thờiĐây là phương pháp bảo quản dài hạn các vật liệu trong hoặc trên bề mặt nitơ lỏng (-1960C). Quy trình bảo quản gồm các bước sau: + Tách mẫu nuôi cấy đang ở pha sinh trưởng mạnh để đưa vào bảo quản. + Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu cấy bằng dung dịch 5 - 10 % proline, 3 - 6 % manitol có bổ sung thêm chất chống đông. + Xử lý lạnh đến nhiệt độ đông băng ổn định của tế bào chấtĐưa vào bảo quản trong hoặc trên mặt nitơ lỏng (- 1960C). Làm tan tuyết, xử lý ở nhiệt độ 35 – 400C trong điều kiện phòng thí nghiệm bình thường. Phục hồi sinh trưởng, tái sinh cây. Sơ đồ bảo quản siêu lạnh(Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật)Biện pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời áp dụng thành công cho các đối tượng:+ Mô sẹo. + Tế bào hạt phấn. + Mô phân sinh Ví dụ: người ta đã nghiên cứu mô phân sinh của khoai tây và đưa vào bảo quản đông lạnh cho tỉ lệ phục hồi tái sinh cao xấp xỉ 36%.III. KẾT LUẬNKỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi in vitro là kỹ thuật hiện đại có thể sử dụng để khắc phục sự bất hợp ở thực vật. Các phương pháp này đang được ứng dụng phổ biến trên thế giới và đã thu được nhiều thành tựu như: lai noãn đại mạch với phấn của mạch đen và của lúa mì, lai thuốc lá trồng với thuốc lá dại, tạo hạt tam bội từ Brassica paconenusis x B. sinensis, lai xa ở một số chi thuộc họ cà, họ hòa thảoBảo quản nguồn gen thực vật in vitro là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực vật nhất là với các cây nhân giống vô tính và có hạt mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp. Tuy nhiên do chi phí đầu tư tốn kém và yêu cầu kỹ thuật cao nên việc ứng dụng phương pháp này vẫn còn khá hạn chế ở Việt Nam.Tài liệu tham khảoNghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa và phôi vô tính từ nuôi cấy noãn ở 1 số giống CAQ có múi. (Viện di truyền nông nghiệp, Đại học Quốc gia Hà Nội).Ứng dụng CNSH trong chọn tạo giống chè mới, viện KHKT NLNMN phía bắc.Rút ngắn thời gian nhân giống hoa lily, Lê Thị Thúy Nga, Nguyễn Thị Thanh Hoa, SV ĐH Nông Nghiệp Hà Nội, giải thưởng Vifotech 2008, www.tchdkh.org.vn.Kỹ thuật cứu phôi - Bước đột phá trong chọn tạo giống hoa lily mới. Viện nghiên cứu Rau-Quả. XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!