Nucleic acids và dòng thông tin sinh học

Nucleic acids và dòng thông tin sinh họcNội dung:Cấu tạo của các Nucleic acidSinh tổng hợp các nucleic acidPhân giải nucleic acidMột số kỹ thuật nghiên cứuKích thước genome của các loài khác nhauLoàiKích thước genome haploide (kbp)Echerichia coliNấm men (Saccharomyces cerevisie)Nematode worm (C.elegans)Ruồi dấm (Drosophila melanogaster)Người (Homo sapiens)NewtsThực vật:Arabidopsis thalianaBôngĐậu tươngThuốc láĐậu Hà LanLúa mỳNgô4,2 x 1031,5 x 1048,0 x 1041,5 x 1052,0 x 1065,0 x 1078,0 x 1047,2 x 1051,3 x 1062,4 x 1064,8 x 1065,2 x 1065,7 x 106I. Cấu tạo của các nucleic acid Có 2 đường Pentose:  β-D Ribofuranose (β-D Ribose )	  2- Deoxy β-D Ribofuranose 	 (2-Deoxy β-D Ribose )DNA: 2-Deoxy β-D Ribose ; RNA: β-D Ribose 1.1. Thành phần hoá học1.1.1. Đường PentoseI. Thành phần hoá học1.2. Base nitơ	1.2.1. Các base purinAdenin, Guanin. DNA, RNA: A,G	1.2.2. Các base pirimidinCytosine, Thimin, Uraxil. DNA: C, T; RNA: C,U* Base nitơ hiếm: Dẫn xuất Methyl của các base purin và pirimidin.	Hiện tượng hỗ biến của các base nitơ1.1.3. NucleosideNucleoside – N-Glycoside của các base nitơLiên kết N-Glycoside được hình thành giữa:N9 của base purin với C1 của đường PentoseN1 của base pirimidin với C1 của đường Pentose1.1.4. NucleotideNucleotide là Este photphoric của các nucleosideFigure 4.5: Ultraviolet spectra of ribonucleotides.Data from A. L. Lehninger, D. L. Nelson, and M. M. Cox, Principles of Biochemistry, 2nd ed. (New York: Worth, 1993), p. 330, 12.10. â 1993, 1982 by Worth Publishers, Inc. Used with permission. 1.2. Cấu tạo của axit nucleic1.2.1. Cấu tạo của DNA:	Phân tử DNA được tạo thành từ 2 mạch Polynucleotide. Mỗi mạch Polynucleotide được hình thành từ các mắt xích Deoxymononucleotide (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP) liên kết với nhau băng liên kết Dieste photphoric	1.2.1.1. Cấu trúc bậc nhất	1.2.1.2. Cấu trúc bậc 2 (Mô hình J.Watson và F.Crick) 1.2.1.1. Cấu trúc bậc nhấtLà số lượng và trình tự sắp xếp các mắt xích DeoxyribonucleotideLiên kết: Dieste photphoric được hình thành giữa axit photphoric với –OH ở C5’ của một mononucleotide này với –OH ở C3’ của mononucleotide bên cạnh.Mạch Polinucleotide có cấu trúc mạch thẳng.Cơ sở cho việc xây dựng Mô hình chuỗi xoắn kép: Quy tắc Chargaff Kết quả nghiên cứu về tinh thể DNA bằng phương pháp nhiễu xạ tia X của R. Franklin và M.Wilkinsa. Quy tắc E. Chargaff:Trong DNA A = T, G = C (Hàm lượng Mol)G + C khác với A + T: Nấm men nghèo G + C, vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis lại giàu G + C=> Tỷ lệ các base purin so với các base pyrimidin là 1 : 11.2.1.2. Cấu trúc bậc hai (Mô hình Watson và Crick)Tỷ lệ các base nitơ trong DNALiên kết hydroSự cặp đôi giữa các base nitơ ở hai mạch polynucletideComparison of the two major forms of DNA So sánh 2 dạng A và B của DNACấu trúc dạng B của DNAMô hình cấu tạo của DNAĐường kính vòng xoắn: 2,37 nmMột “bước” : 0,33 nm, 1 vòng xoắn hoàn hảo: 3,4 nm10,4 bp tạo một vòng xoắn hoàn hảo, góc giữa 2 nucleotide kề nhau: 34,6oCác lực:Liên kết hidroHiệu ứng kỵ nướcTương tác xếp chồng (Lực Van der Waals)Tương tác giữa các nhóm tích điện1.2. Cấu tạo của Nucleic acid2.2. Cấu tạo của RNA	2.2.1. Cấu trúc bậc nhất: Số lượng và trình tự sắp xếp các mononucleotide trong mạch polynucleotide	Viết tắt: AGCUUGACC	Liên kết: Dieste photphoric	2.2.2. Cấu trúc bậc 2, 3: 	RNAt có cấu trình lá chẽ ba (Cloverleaf) Cấu tạo của RNAtNhững cặp đôi không bình thườngCác dạng cấu hình của axit nucleic một mạchCấu trúc bậc 3 của RNAtStructure of a small nuclear RNA (snRNA).Câú tạo RNAs trong nhân (snRNA)Host-induced restriction and modification. 2.3. Enzym cắt hạn chế (Restriction endonuclease)1.4.1. Phân loại: 3 nhómPhản ứng Methyl – hoáPhản ứng thuỷ phânCơ chế tác động của RNase ARE nhóm I: Xúc tác cả p.ư. Methyl hoá và thuỷ phân trên 2 mạchRE nhóm II: Xúc tác chỉ p.ư. Thuỷ phânRE nhóm III: Xúc tác cả p.ư. Methyl hoá và thuỷ phân trên 1 mạchTính chất của RE của các nhóm I, II và III1.4.2. Tính đặc hiệu của một số RE1.4.3. ứng dụng RE:Xây dựng bản đồ cắt hạn chế DNA (restriction map of DNA)Là công cụ để phân lập và gắn gen Cơ sở để so sánh các loài theo phương pháp RFLP (Random Fragment lengh Polymorphism)Sự thuỷ phân DNA của Bacteriophage Lamda bởi 4 REII. Sinh tổng hợp các nucleic acid2.1. Sinh tổng hợp DNA2.2. Sinh tổng hợp RNADòng thông tin di truyềnThe flow of genetic information in a typical cell.Tái bảnPhiên mãDịch mã2.1. Sinh tổng hợp DNA (Tái bản - 	Replication) Phương trình tổng quát n dATP DNA làm khuôn dAMP dGTP DNA Polymerase dGMP dCTP dCMP + nPP dTTP dTMP n2.1.1. Cơ chế tái bản DNABa kiểu tái bản DNA Kiểu tái bảnBảo thủBán bảo thủPhân tánCơ chế tái bản bán bảo tồnThí nghiệm của Meselson & Stahl 2.1.2. Enzym tái bảnDNA Polymerase I: Sửa chữa DNA và tổng hợp 1 mạch DNA, cắt bỏ RNA mồiDNA Polymerase II: Sửa chữa DNA SOS DNA Polymerase III: Tổng hợp DNA E.Coli chứa:Các tế bào có nhân có 5 DNA Polymerase: 4 trong nhân, 1 trong ti thểCấu tạo dna polymerase III của E.coliCơ chế chuyển nhóm nucleotidyl (Nucleotidyl group- transfer reaction)Sơ đồ chẽ ba tái bản (Replication fork) và hướng tổng hợp 2 mạch2.1.3. Cơ chế tái bảnA model for initiation of E. coli DNA replication at oric. a. Mở đầu quá trình tái bảnThe Okazaki model. b. Giai đoạn tổng hợpSimplified view of a replication fork.Chẽ ba tái bảnSchematic view of a replication fork. c. Sinh tổng hợp mạch kế tiếp (Lagging - strand Synthesis)Details of lagging strand synthesis Chi tiết về tổng hợp mạch kế tiếp (Lagging Strand)Sự tái bản ở tế bào có nhân thật:E. coli:Mở đầu: Topoisomerase, Helicase cới xoắn, SSB protein chống tái xoắn, Primase – RNA polymerase tổng hợp RNA mồiDNA Polymerase: 3Một điểm bắt đầu tái bảnĐoạn Okazaki: 1000 – 2000 bpTế bào có nhân thật:Nhiều enzym tham gia: Topoisomerase, Helicase, SSB protein, primase DNA Polymerase: 4 Có nhiều điểm tái bản (TB nấm men – Hàng trăm, TB ruồi dấm – 6000, TB người – 20.000 – 30.000 điểm)Đoạn Okazaki: 100 – 	200 bpTốc độ tái bản: 1.000 – 1.500 nucleotide/ phút2.1.4. Sửa chữa sai sót trong quá trình tái bảnCác hệ thống giảm sai sót gồm:Cơ chế đọc sửa (Proofreading)Hệ thống uracil-DNA N-glycosylase chống lại đột biến do sự khử amin hoá cytosine Sự ổn định hoá học của DNA được đảm bảo:Quá trình tái bản có độ chính xác cao phòng các sai sót xảy raBằng các cơ chế sửa chữa sai sót trong quá trình tái bản2.1.4.1. Đọc sửa Quá trình tái bản xảy ra với tỷ lệ sai là 10-9 – 10-10 Chức năng đọc sửa do DNA Polymerase có hoạt tính 3’- exonuclease Quá trình đọc sửa làm giảm sai sót xuống 100 lần2.1.4.2.Hệ thống uracil-DNA N-glycosylaseHệ thống gồm:Uracil-DNA N-GlycosylaseEndonucleaseDNA Polymerase IDNA LigaseCác cơ chế sửa chữa khác:1. Sửa chữa trực tiếp (Direct repair): Base bị lỗi của DNA được phục hồi cấu tạo bằng phương pháp hoá học2. Cắt bỏ – Sửa Nucleotide (Nucleotide excision repair): Phần DNA chứa sai sót được cắt bỏ và thay thế bằng DNA bình thường, 3. Cắt bỏ – Sửa chữa base (Base excision repair): Bắt đầu bằng sự thuỷ phân liên kết glycosidic bond nối base bị lỗi với khung đường -phosphate của DNA4.Sửa chữa tái tổ hợp (Recombinational repair): Xoắn kép DNA mới tái bản bị tái tổ hợp loại đi đoạn DNA bị lỗi.5. Sửa lỗi sai bỏ qua (Mismatch repair (prokaryotic or eukaryotic)): Quá trình nhận biết các lỗi bỏ qua của DNA do các lỗi sai tái bản, tái tổ hợp không tương đồng hay sai sót gây cho 1 base của DNA và sửa chữa ngay lỗi sai.Excision repair of thymine dimers by the UvrABC excinuclease of E. coli. Base excision repair of thymine dimers. Recombinational repair PCR – Polymerase Chain Reaction2.1.5. Phản ứng nhân gen PCR2.2. Quá trình phiên mã - 	(RNA Transcription)Phương trình tổng quát (Konberg): n ATP DNA làm khuôn AMP GTP RNA Polymerase GMP CTP CMP + nPP UTP UMP nRNA mớiRNA Polymerase ở Eukaryote:3 loạiRNA Polymerase I: Xúc tác phiên mã khoảng 60% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAr (28S, 18S và 5,8S)RNA Polymerase II: Xúc tác phiên mã khoảng 30% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAm, một số RNAsRNA Polymerase III: Xúc tác phiên mã khoảng 10% RNA tổng số, chủ yếu là các RNAt, RNAr 5S và một số RNAs khác (U1, U2, U3)2.2.1. Enzyme phiên mãRNA - PolymerasePhản ứng do RNA Polymerase xúc tácGiai đoạn mở đầu:RNA – PolymeraseTrình tự mở đầu Giai đoạn tổng hợp:Yếu tố σ tách khỏi RNA – PolymeraseTổng hợp: Gắn dần các gốc ribonucleotide vào 3’C-OH Giai đoạn kết thúc:Hai cơ chế: - Yếu tố Rho - Tạo cấu trúc kẹp tóc2.2.2. Các giai đoạn của phiên mãGiai đoạn mở đầu gồm các bước 1 - 42.2.2.1. Mở đầuPhức hợp Promoter đóng (-55 đến -5), DNA chưa mở xoắnPhức hợp Promoter mở, DNA mở xoắn vài base (-10 đến -1)Gắn pppPu vàoRNA Polymerase gắn vào DNA, trượt tự doConserved sequences in promoters recognized by E. coli RNA polymerase. Trình tự mở đầuVùng -35Vùng -10Initiation and elongation steps of transcription by bacterial RNA polymerase. 2.2.2.2. Tổng hợp (Kéo dài)Phức hợp Promoter mởQuá trình kéo dài bắt đầuThe transcription bubble. “Phồng” phiên mãRho factor (p)-dependent termination. 2.2.2.3. Kết thúcQúa trình phiên mã kết thúc bằng 2 cơ chế:a. Yếu tố RhoA model for factor-independent termination of transcription.  b. Kết thúc không phụ thuộc yếu tố Rho 2.2.3. Hoàn thiện sau phiên mã2.2.3.1. Hoàn thiện RNAm Gắn “mũ” đầu 5’ – OH Gắn đuôi PolyA Cắt bỏ vùng không mã hoá (exon)    Figure 28.30: Overall structure of a fully processed eukaryotic message, including the cap site                                                                                                                 Gắn “mũ” đầu 5’A schematic view of the proposed mechanism for mRNA splicing Cắt bỏ vùng không mã hoá của RNAm ở tế bào EukaryoteA proposed model for the mechanism of splicing Coding and noncoding regions of the hemoglobin gene. Cắt bỏ vùng (Splicing) không mã hoáHemoglobin geneα-Tropomyosin gene organization (rat) and seven alternative splicing pathways. Cắt bỏ tương đối (alternative splicing )a. Hoàn thiện sau RNAr ở E.coli (30S E.coli RNAr)2.2.3.2. Hoàn thiện sau phiên mã 	 RNAr và RNAtHoàn thiện của E. coli RNAtA map of the lactose operon. 2.2.5. Điều hoà quá trình phiên mãConfigurations of the lactose operon.Kiểu “đóng – mở”Activation of the lac operon. cAMP receptor protein(Negative and positive control)Điều hoà bằng cAMPĐiều hoà quá trình phiên mã của quá trình STH tryptophancAMP Receptor Protein (CRP)Negative and positive control - The lac repressor--operator system keeps the operon turned off in the absence of utilizable -galactosides. An overlapping regulatory system (Figure 26.21) turns the operon on only when alternative energy sources are unavailable. E. coli uses glucose in preference to most other energy substrates. When grown in a medium containing both glucose and lactose, the cells metabolize glucose exclusively until the supply is exhausted. Then the lactose operon becomes activated in preparation for continued growth using lactose. This phenomenon involves a transcriptional activation mechanism, which occurs when glucose levels are low. Control is exerted through intracellular levels of cyclic AMP.cAMP controls in E. coli - In E. coli, cAMP levels are low when intracellular glucose levels are high. Adenylate cyclase (the enzyme that catalyzes formation of cAMP) apparently senses the intracellular level of an unidentified intermediate in glucose catabolism. Hence, the current name for the regulatory process is catabolite activation. When glucose levels drop, as shown in Figure 26.21, cAMP levels rise and cAMP interacts with a protein called cAMP receptor protein (CRP). When it binds cAMP, CRP undergoes a conformational change. The change greatly increases its affinity for certain DNA sites, including a site in the lac operon adjacent to the RNA polymerase binding site. Binding of cAMP--CRP at this site protects a DNA sequence from -68 to -55, as shown in Figure 26.19. This binding facilitates transcription of the lac operon by stimulating the binding of RNA polymerase to form a closed-promoter complex.The cAMP--CRP complex activates several different gene systems in E. coli, all of them involved with energy generation. They include operons for utilization of other sugars, including galactose, maltose, arabinose, and sorbitol, and several amino acids. Among the operons that have been analyzed, the DNA binding site of the cAMP-activated dimer varies considerably with respect to the transcriptional start point, suggesting that regulatory mechanisms involving this protein are complex.The CRP - DNA Complex - The structure of the CRP-cAMP-DNA complex, as revealed by x-ray crystallography, shows how the protein binds to DNA. Each CRP subunit contains a characteristic pair of helices, called a helix-turn-helix structural motif (see Figure 28.23). It is found in several DNA-binding regulatory proteins, suggesting common evolutionary origins for this family of proteins. Analysis of the DNA - protein complex shows that CRP induces DNA to bend quite sharply when it binds. This bending may facilitate the initiation of transcription by bringing DNA sequences farther upstream into direct contact with the promoter or transcriptional start site.The E. coli ara operon. Ara OperonArabinose Operon                                                          The arabinose operon features aArabinose Operon The arabinose operon features a single protein which acts as both a positive and a negative transcriptional regulator, depending upon the binding of particular ligands (Figure 26.39).Three structural genes are located in the arabinose operon--araB, araA, and araD. They encode enzymes that convert arabinose to xylulose-5-phosphate.Regulation - The araC gene encodes a regulatory protein that binds to arabinose, the inducer of the operon. Binding of the AraC - arabinose complex at a site called araI activates transcription of the arabinose operon, but only when the cAMP - CRP complex (see here) is bound at an adjacent site. Thus, whereas the lac operon requires one protein to be bound and one to be dissociated for maximal transcription, the arabinose operon requires two proteins to be bound at adjacent sites.When arabinose levels are low, the AraC protein acts as a repressor and binds to two operator sites, araO1 and araO2, as well as to araI. Binding to araO1 inhibits transcription of the araC gene itself. Thus, araC is autoregulated at the level of its own transcription. AraC molecules bound to araO2 and araI interact with each other to form a DNA loop. This structure causes repression of transcription of the araBAD genes.Galactose Operon The galactose operon (Figure 26.38) controls the utilization of galactose, one of the products of lactose cleavage by lac operon enzymes. The gal operon is regulated negatively by a repressor in a manner comparable to lac regulation, except that the repressor gene (galR) is unlinked to the structural genes.Overlapping promoters - The gal operon contains two overlapping promoters (S1 and S2, Figure 26.38), leading to transcripts that are initiated just five nucleotides apart.1. Transcription from the S1 promoter depends on the presence of the cAMP - CRP complex (see here).2. The S2 promoter, is used when glucose is present.The details of this dual regulation are not clear, but it is significant that galactose has a biosynthetic fate in addition to its role as an energy substrate. UDP-galactose is used in synthesis of cell wall lipopolysaccharide, so the second promoter may exist to ensure that UDP-galactose is available even when the cell is using glucose as its prime energy source.III.Phân giải Nucleic acidSơ đồ phân giải Nucleic acid3.1. Phân giải các base purine a. Phân giải các base purine và sự hình thành uric acid b. Sự phân giải uric acid thành NH3 và CO2Sự tích luỹ dư thừa uric acid và bệnh gout3.2. Sự phân giải các base 	pyrimidineSản phẩm: Alanine NH3 CO2IV. Một số kỹ thuật nghiên cứu nucleic acid6.1. Thu nhận DNA genome6.2. Xác định trình tự nucleotide6.3. Kỹ thuật nhân gen (PCR – Polymerase Chain Reaction)6.4. Điện di trên gel agarose và xử lý hình ảnh sau điện di