Quy trình nuôi cấy phôi hữu tính in vitro

Giới thiệu chung Một hướng đi mới của công nghệ tế bào thực vật hiện nay là công nghệ nuôi cấy phôi in vitroVậy phôi là gì? Nuôi cấy phôi in vitro là như thế nào?Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát triển tạo thành cơ thể hoàn chỉnh là pha phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào soma và bào tử thể.Có hai loại phôi: phôi hữu tính & phôi vô tính ( phôi soma)Phân biệt phôi hữu tính và vô tínhPhôi hữu tính : được hình thành và phát triển từ những tế bào sinh dục : sau khi sự thụ tinh đôi xảy ra: một hạt phấn thụ tinh với noãn và thành lập hợp tử lưỡng bội, một loạt các phân cắt đẳng nhiễm xảy ra, hợp tử phát triển thành phôi ( bào tử thực vật mới ). Các giai đoạn phát triển phôi hữu tínhSO SÁNH PHÔI HỮU TÍNH VÀ PHÔI VÔ TÍNHPhôi soma là phôi được phát sinh từ tế bào sinh dưỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và tế bào ấy có cấu trúc như một phôi gọi là phôi vô tính ( phôi soma).PHÔI SOMAQuy trình nuôi cấy phôi invitro* Quy trình nuôi cấy phôi hữu tính* Quy trình nuôi cấy phôi vô tínhQuy trình nuôi cấy phôi hữu tính in vitro* Sự phát sinh phôi hữu tính: - Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử- Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôiQuá trình phát sinh phôi hữu tínhquy trình nuôi cấy phôi hữu tính* Tách phôi:Phôi hữu tính được hình thành trong môi trường vô trùng của noãn và mô bầu hoa. Dùng kỹ thuật tách phôi và đưa vào môi trường ở điều kiện vô trùng.+Ở một số loài phôi có kích thước lớn, thuận tiện cho quá trình tách phôi ( cây họ đậu), nhưng một số loài hoa khó tách phôi ( hoa lan)+ Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thường xếp ở đỉnh hoaTrong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế sự tổn thương của dây treo phôi.Quy trình nuôi cấy phôi hữu tính*Thành phần môi trường nuôi cấy Muối khoáng: môi trường MS có hàm lượng các ion K+ và Ca + giảm hàm lượng NH4+Chất điều hòa sinh trưởng: thêm auxin, cytokinin hoặc từng loại riêng rẽ. Nguồn cacbon từ đường saccharose, nồng độ thay đổi tùy theo từng giai đoạn phát triển. Phôi trưởng thành cần khoảng 2%, phôi non cần hàm lượng cao hơn.Axit amin và các thành phần hữu cơ phức hợp: các axit amin có thể sử dụng riêng rẽ hay phối hợp như Glutamin và Cazein.- Nội nhũ: + Các phôi non thường khó nuôi cấy trong môi trường nhân tạo đặc biệt là phôi hình thành từ phép lai xa. + Cấy phôi vào môi trường nội nhũ đảm bảo phát triển bình thườngQuy trình nuôi cấy phôi vô tính*Sự phát sinh phôi soma:Phôi soma được hình thành từ:- Các tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành- Các mô tái sinh không phải là hợp tử- Các lá mầm và trụ dưới lá mầm của phôi và cây con không qua bất cứ sự phát triển nào của mô sẹo Phôi vô tính phát sinh ngẫu nhiên trong quá trình nuôi cấy, sự phát sinh phôi vô tính có thể khởi đầu từ hai con đường:-Phát sinh phôi xảy ra trực tiếp không qu a mô sẹo, phôi hình thành từ những tế bào được xác định là tiền phôi-Phôi hình thành từ các tế bào phôi hóa cảm ứng trong mô sẹo* Các sự kiện quan trọng quyết định liên quan đến chương trình sớm của quá trình phát triển:- Cảm ứng biệt hóa tế bào của những tế bào tiền phôi .- Biểu hiện trình tự phát triển ở các tế bào tiền phôi.Hình cầuHình timHình cá đuốiNuôi cấy phôi somaCác tế bào tiền phôi có khả năng biệt hóa nhưng sự phát triển của chúng có thể bị ngăn cản do mất cân bằng của các chất trong môi trường nuôi cấy. Sự hình thành các cụm phát triển phôi và sự kết dính phôi có thể xảy ra nếu những môi trường có nồng độ auxin cao sau khi tế bào đã biệt hóa.Hai loại môi trường đước sử dụng: + Môi trường có auxin: tạo các tế bào có khả năng phát sinh phôi+ Môi trường không có auxin hoặc có với nồng độ thấp: môi trường cho những tế bào phát triển thành phôiCác bước nuôi cấyChọn mẫu cấyKhử trùng mẫuTách mẫuĐưa vào môi trường nuôi cấy phôi Duy trì quá trình phát sinh phôi đồng nhất Tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi somaChọn mẫu cấy	Mẫu có thể là :*	Tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành *	Các tế bào sinh sản không phải là tế bào sinh dục *	Lá mầm hay trụ dưới lá mầm của phôi hợp tử 	mà cây con không thông qua sự phát 	triển từ mô sẹo.Khử trùng mẫu	Người ta thường sử dụng các dung dịch khử trùng thông thường như Ca-hypochlorite , Na-hypochlorite , thủy ngân clorurNgoài ra người ta còn dụng thêm các chất hoạt động bề mặt như Tween 80 , teepol , mannoxolMôi trường hóa học nuôi cấy*Các chất điều hòa sinh trưởng:+ Auxin+ Cytokinin*Nguồn nitơ: ảnh hưởng đến sự hình thành phôi và sự sinh trưởng của phôi trông nuôi cấy-Thường sử dụng ở các dạng: các nitơ hữu cơ(glutamin, asparagin, cazenin thủy phân, nước dữa)*Thạch và các chất khác:- Sử dụng hàm lượng thạch từ: 0.5-1.5% , đối với các nuôi cấy huyền phù tế bào thì sử dụng môi truờng lỏng nuôi cấyMôi trường vật lý nuôi cấy phôiÁnh sáng: + Giai đoạn cảm ứng tạo tế bào tiền phôi cường độ ánh sáng thấp+ Giai đoạn tái sinh phôi thì cường độ ánh sáng cao hơnNhiệt độ tối ưu trong nuôi cấy là 25±2oC Công nghệ nuôi cấy phôi invitro có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, khắc phục được những nhược điểm của sự hình thành phôi trong tự nhiên. Trở thành ngành công nghệ đáng quan tâm trong sản xuất* Thu nhận thể đơn bội Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận các thể đơn bội thông qua quá trình loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa. Tổ hợp giữa hai loài càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn NST đơn bội của một loài càng dễ xảy raỨng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính* Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt:Nuôi cấy phôi hữu tính được dùng để kiểm tra nhanh khả năng nảy mầm của hạt, đặc biệt là các hạt giống có sức sống kém và hạt sau thời gian bảo quản dài. Phương pháp này cho độ chính xác caoỨng dụng của nuôi cấy phôi hữu tínhỨng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính* Nhân giống các cây hiếmHạt của một số cây rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vì vậy làm giảm khả năng sinh sản hữu tính của chúng. Bằng cách nuôi cấy phôi tách rời đã thu được rất nhiều cây con. Áp dụng với loài mà hạt có sức sống kém, hạt không có nội nhũ hoặc ít nội nhũ: VD: đối với các loài phong lan hạt của chúng rất nhỏ và không có nội nhũ vì vậy khả năng này mần của hạt là rất thấp vì vậy bằng phương pháp nuôi cấy phôi ta sẽ làm tăng tỉ lệ nảy mầm của phong lan.Thụ phấn trong ống nghiệmĐể khắc phục các hiện tượng như vỡ ống phấn, bất hợp giữa hai giao tử khi lai xa người ta đã áp dụng kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm qua các bước sau:Tách bầu chứa noãn và nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Kích thích hạt phấn nảy mầm Kích thích sinh trưởng của ống phấn Hạt phấn được đặt cẩn thận vào đầu nhụy Nuôi hợp tử để phát triển thành phôi và hạt trong điều kiện in vitro Trên cơ sở của quy trình này người ta đã thành công với các loài như cà chua, dưa chuột, cam quýt, một số loài họ hòa thảo như đại mạch, lúa mạch đen,lúa mỳ,Ứng dụng của nuôi cấy phôi vô tínhHầu hết các loài thực vật được nhân giống bằng hạt, chẳng hạn như : Hạt lúa, hạt bắp, hạt hoa, hạt rau. Nhưng đó chỉ là hạt giống hữu tính, được tạo ra từ quá trình thụ phấn ở cây trồng. Như một thể nhân giống, hạt giống có thể được trồng trọt nhanh với  những thiết bị cơ giới. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống từ hạt không hiệu quả do tỷ lệ hạt nảy mầm thấp, không đảm bảo độ đồng đều và không đảm bảo về mặt di truyền. Vì vậy, nhân giống vô tính hiện được xem là một phương pháp hiệu quả để tạo ra một số lượng lớn cây giống đạt chất lượngỨng dụng của nhân giống vô tính Nhân giống nhanh và dễ dàng đối với những đối tượng:Loài khó sinh sản hữu tính: thời gian ra hoa lâu, tỉ lệ đậu quả ít.- Không thể nuôi cấy phôi hữu tính được.- Nhân giông nhanh những kiểu di truyền mong muốn(giống chọn lọc,cây chuyển gen).- Nhân giống kiểu di truyền giống cha hoặc mẹ cho sản xuất các thế hệ lai F1.Ứng dụng của nuôi cấy phôi vô tínhỨng dụng của công nghệ nuôi cấy phôi vô tính (phôi soma) là tạo phôi vô tính; tạo củ siêu nhỏ (micro), hạt nhân tạo; công nghệ hóa quá trình nhân giống, vườn ươm và xây dựng mô hình trồng thử.Sự ra đời của hạt nhân tạo đem lại ý nghĩa rất to lớnHạt vô tính gồm 3 phần: + Phôi vô tính + Vỏ bọc polyme (alginate, agrose,) + Màng ngoài (alginat caxi)Trạng thái phát triển của phôi vô tính được duy trì ở nhiệt độ thấp hoặc dùng các chất ức chế trước khi bao hạtKhi sử dụng đem hạt vào môi trường thích hợp phôi này sẽ nảy mầm tạo thành cây hoàn chỉnh.Các bước cơ bản tạo hạt nhân tạoTạo mô sẹo phôi hóa Nuôi và nhân tế bào trong dịch lỏng Lọc lấy các cụm tế bào phôi hóa nhỏ đồng nhất Đưa tế bào tiền phôi vao nuôi cấy trong môi trường thích hợp Làm khô và bọc màng nhân Tiến hành bảo quản Thành tựuỨng dụng của công nghệ nuôi cấy phôi invitro đã phát triển nhân nhanh một số giống công nghiệp và bán công nghiệp đối với một số loài hoa và cây lâm nghiệp có giá trị kinh tế cao; tuyển chọn được 18 giống hoa Lili, 10 giống Hồng môn với những sắc màu, kiểu dáng đa dạng có giá trị kinh tế cao và trên 15 vạn cây giống Sa nhân, Tếch, Trầm hương...  Quy trình công nghệ nhân nhanh giống cây hương liệu và dược liệu, cây gỗ Tech - một loại vật liệu đóng tàu có giá trị cao - và Sa nhân tím - một loài quý hiếm đã được các nhà nghiên cứu hoàn thiện đưa vào sản xuấtMột thành công quan trọng khác đó là tạo phôi trực tiếp từ lát mỏng tế bào không qua giai đoạn mô sẹo đối với các dòng cây - Bạch đàn. Qua đó, các nhà khoa học đã thực hiện việc chuyển gene thông qua lớp mỏng tế bào để nâng cao hệ số nhân giống. Với những kết quả thử nghiệm đạt được, quy trình công nghệ nhân giống hoa Lili, Hồng môn, gỗ Tếch, Trầm hương đã trở thành tiến bộ kỹ thuật được ứng dụng vào sản xuất giống trên quy mô rộng. Cho đến nay, trên 200 loài cây trồng đã được nhân giống bằng công nghệ phôi vô tính. Phôi vô tính có thể bảo quản lâu dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Từ phôi vô tính có thể tạo hạt nhân tạo, đây là yếu tố thuận lợi cho cơ giới hóa và tự dộng hóa nhân giống công nghiệp. Với cây cà phê, từ 1gr sinh khối, trong vài tháng người ta có thể tạo được 60 vạn phôi vô tính có tỷ lệ tái sinh đến 47%._ Hạt khoai tây nhân tạo_ Nuôi cấy phôi cây bông và tạo đa chồi (nuôi cấy phôi hữu tính)._ Hình ảnh quá trình tạo đa chồi cây bông từ phôiTái sinh cây bông thông qua chồi soma_ứng dụng hệ thống Bioreactor trong sản xuất một lượng lớn các cây dược liệu và hoa cảnh mà chủ yếu là ứng dụng trong nuôi cấy phôi sôma._tạo hạt nhân tạo thành công với cây Địa Lan._hạt địa lan nhân tạo được boc bằng vỏ bọc Sodiumal alginate.