Vi sinh môi trường

đại nội mật thám full
đặt nhiệm tôi cao (phim hong cong)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
–&—
BÁO CÁO THỰC HÀNH
 VI SINH MÔI TRƯỜNG
 	GVHD : Ths. Lê Thị Kim Phượng
 	1. Trương Thị Thanh Hương	08070410
 	2 . Trần Thị Ngọc Hân 	08070365
 	3. Lê Thị Mỹ Linh	08070426
 	4. Nguyễn Thị Khánh Sinh	08070155
	5. Nguyễn Đình Thuận	08070811
Bình Dương -09/4/2012
NỘI DUNG
BÀI 1. XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ	3
BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN...7
BÀI 3. KIỂM TRA E.coli	9
BÀI 4. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CỦA VI SINH VẬT	15
BÀI 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
I. Định nghĩa và nguyên tắc
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối thực phẩm.
Quy trình phân tích bao gồm các bước:
- Cân mẫu
- Đồng nhất mẫu
- Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân 
- Chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên mặt môi trường rắn trong đĩa petri bằng phương pháp hộp trải, hoặc hộp đổ.
- Ủ ở nhiệt độ và thời gian quy định
Trong đó, điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ thay đổi tuỳ theo yêu cầu phân tích và quy định của từng quốc gia. Tiêu chuẩn của từng quốc gia quy định ủ ở 30C trong 3 ngày. Một số tiêu chuẩn khác quy định ủ ở 20-22C trong cùng thời gian trên.
Chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ gây hư hỏng, thời gian bảo quản của sảm phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm.
II. Dụng cụ và thiết bị cần chuẩn bị
Đèn cồn, diêm quẹt
Đĩa Petri
Que cấy
Pipet 1ml, 10ml 
Erlen 100ml, 150ml,250ml
Bercher 50ml
Ống nghiệm
Giấy thấm
Cồn 96 và 70o
Mẫu phân tích : nước thải
III. Môi trường và hóa chất
Môi trường sử dụng là PCA có Ph 7,0 ± 0,2. Môi trường được pha chế, phân phối vào trong các bình thủy tinh hay trong các ống nghiệm và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Các bình hoặc các ống nghiệm chứa môi trường chưa được sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2- 8 oC. Trước khi sử dụng phải đun chảy và làm nguội ở 45 oC
Dung dịch nước muối peptone SPW ( Saline Pepton Water) dùng để pha loãng. Pha 600ml
Môi trường PCA pha 350ml
IV.Quy trình phân tích
1.Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích
 - Trước khi tiến hành phân tích, thực hiện việc đồng nhất như sau:
 - Đối với mẫu dạng lỏng: hút 10ml cho vào bình tam giác chứa 90ml nước SPW đã được hấp khử trùng, lắc điều.
 - Dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10 so với ban đầu
 - Sau đó chuyển 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng, lắc điều, dung dịch này có độ pha loãng la 10. Sau đó sử dụng cùng pipet hoặc pipetman có cùng đầu tip chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm thứ 2 có chứa 9ml dung dịch pha loãng và thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10. Tiếp tục thực hiện tương tự để có độ pha loãng cần thiết
 2.Cấy mẫu
Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25-250 tế bào vi sinhvật trong 1ml để cấy lên đĩa peptri. Dùng pipep vô trùng hoặc pipepman với đầu tip vô trùng chuyển 1ml mẫu pha loãng đã chọn vào giữa peptri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2-3 đĩa. Sau khi cấy đổ vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45C. Trộn điều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa peptri xuôi và ngược kim đồng hồ, mỗi chiều 2-5 lần ngay sau khi đỗ môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang mặt thạch đông đặc. lật ngược và thời gian ủ các đĩa trong trong tủ ẩm ở nhiệt độ 30-40C trong 72h.
3.Tính toán kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ.
 A (CFU/g hay CFU/ml) = 
Trong đó: 
A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1g hay 1ml mẫu
N: số khuẩn lạc đếm được ở tất cả các đĩa
n: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng tương ứng
V: thể tích mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.
f: nồng độ pha loãng tương ứng.
Trình tự tiến hành:
Chuẩn bị :
Mẫu nước sông cần kiểm tra 
1 bình tam giác 250ml có chứa 90ml dung dịch pha loãng mẫu SPW 
3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch pha loãng mẫu.
1 bình tam giác chứa 80ml môi trường Plate Count Agar (PCA). 
4 đĩa petri (đã được hấp khử trùng). 
Tiến hành :
Lấy 10 ml mẫu nước sông sau khi lắc đều. cho mẫu vào bình tam giác chứa 90ml dung dịch SPW, lắc điều rồi hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm 1 ta được độ pha loãng 10-2, tiếp tục hút 1ml từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 ta được độ pha loãng 10-3.
Lưu ý hạn chế nguy cơ tạp nhiễm trong thao tác.
Chọn 2 ống nghiệm có độ pha loãng là 10-2 và 10-3. Cấy 1ml dịch mẫu pha loãng từ mỗi ống cho vào lần lượt 2 đĩa petri. ( tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa).
Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 15ml môi trường PCA đã đun chảy vào ổn định nhiệt độ khoảng 450C. Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri theo chiều xuôi và chiều ngược kim đồng hồ. Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong khoảng 72h.
Sau thời gian ủ tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc ở mỗi độ pha loãng và tính số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1ml mẫu nước sông.
 Phân tích 1ml mẫu nước sông có kết quả như sau:
Nồng độ pha loãng: 10-2	10-3
Kết quả: Đĩa 1 4 
	 Đĩa 2 38 2
A = 38 = 3,8x103 (CFU/ ml)
 1 x 1 x 10-2 
Nhận xét:
Tổng lượng vi sinh vật hiếu khí trong 1ml nước sông là 3,8x103 (CFU/ml)
Mẫu nước không đạt tiêu chuẩn về mặt vi sinh à không an toàn .
BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
I.Định nghĩa 
1.Conliforms tổng số
Coliform là những trực khuẩn Gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48h.Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48h khi được ủ ở 370C trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật.
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dung để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên, mối quan hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với 1 loài duy nhất là E.coli, Citrobacter, Klebsilla và Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt là IMViC.
2. phương pháp MPN
Phương pháp MPN còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật có xác xuất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường , việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3x3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau: cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm, ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng số liệu này dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn. 
II. Nguyên tắc định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN
Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và sự đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
Trình tự tiến hành: 
Chuẩn bị :
 - Sử dụng lại 3 ống nghiệm có nồng đổ pha loãng mẫu lần lượt là 10-2, 10-3, 10-4 ở bài 2.
 - 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml canh BGBL và có ống bẫy khí Durham
Tiến hành:
 - Tuần tự hút 1ml dịch pha loãng mẫu ở ống nghiệm có nồng độ 10-2 cho vào 3 ống nghiệm chứa canh BGBL, thực hiện tương tự với các ống nghiệm có độ pha loãng 10-3 và 10-4 . Đem ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 370c trong thời gian 48h. Ghi nhận số ống dương tính ( đổi màu và sinh hơi) tương ứng với mỗi độ pha loãng.
Kết quả: Sau 48 giờ quan sát :
Độ pha loãng
10-2
10-3
10-4
Số MPN/ml
Số ống nghiệm dương tính (+)
2
3
3
53
	BÀI 4 : KIỂM TRA E.coli.
 Nguyên tắc:
E.coli trong mẫu nước hay thực phẩm có thể được xác định bằng hương pháp MPN tương tự như định lượng Coliform bằng phương pháp MPN ( bài 3). Trong đó thự nghiệm khẳng định E.coli dựa vào thử nghiệm khả năng sinh Indole, sinh acid ( thử Methyl Red), không sinh Acetoin ( thử nghiệm Voges- Proskauer) và không dùng Citrate ( thử nghiệm khả năng biến dưỡng Citrate) làm nguồn Carbon duy nhất, gọi tắt là IMViC + + - -.
1. Thử nghiệm khả năng sinh Indole.
Nguyên tắc:
Dùng để phân biệt những vi sinh vật có khả năng phân hủy Tryptophane tạo Indole do có enzyme Tryptophanase.
Tryptophane Indole
Môi trường sử dụng là nước Peptone.
Thuốc thử : Kovaes hoặc Erlich.( nhỏ 5 giọt vào mỗi ống nghiệm sau khi ủ)
Kết quả dương tính nếu dung dịch môi trường xuất hiện vòng màu đỏ à có sự hiện diện của indole
Kết quả âm tính nếu dung dịch môi trường không đổi màu à không có sự hiện diện của indole
Các bước tiến hành
Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa 5ml môi trường peptone ở mỗi ống ( 1 ống đối chứng, 1 ống chứa mẫu ).
Dùng que cấy móc lấy khuẩn lạc vi sinh vật cần kiểm tra cho vào ống chứa mẫu.
Sau đó đem cả 2 ống nghiệm đi ủ ở 370C trong 24 – 48 h.
Sau thời gian ủ, đem nhỏ vào mỗi ống 5 giọt thuốc thử Erlich/Kovas và quan sát hiện tượng.
Hình : Kết quả phản ứng Indole sau khi nhỏ thuốc thử Erlich/Kovas
Kết quả:
Dung dịch trong ống chứa mẫu không đổi màu à kết quả âm tính.
Giải thích:	
Thuốc thử Erlich mang gốc aldehyl không kết hợp với Indole tạo màu đỏ 
Nhận xét:
 Trong ống chứa mẫu không có vi sinh vật có khả năng thủy phân Tryptophane sinh Indole. 
2. Thử nghiệm khả năng sinh Acid ( thử nghiệm Methyl Red)
Nguyên tắc:
Dùng để phân biệt những vi sinh vật có khả năng sản sinh và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tinh acid, bền với môi trường, chỉ thị Methyl Red dùng để chỉ thị nồng độ H+ trong môi trường .
Thuốc thử : Methyl Red ( nhỏ 5 giọt vào mỗi ống nghiệm sau khi ủ)
 pH < 4,4 ( môi trường có màu đỏ)
4,5 < pH < 5,8 ( môi trường có màu cam.)
 pH > 6 ( môi trường có màu vàng.)
Kết quả dương tính nếu dung dịch môi trường có màu đỏ à vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm biến dưỡng có tính acid
Kết quả âm tính nếu dung dịch chuyển sang màu vàng à vi sinh vật không có khả năng tạo sản phẩm biến dưỡng có tính acid
Cần đem ủ thêm nếu môi trường có màu cam
	*LƯU Ý: nếu môi trường xuất hiện màu cam chúng ta cần ủ thêm thời gian, nếu từ màu cam chuyển sang màu đỏ ta kết luận kết quả dương tính, còn nếu vẫn màu cam thì kết luận kết quả âm tính
Môi trường sử dụng là môi trường MR – VP. 
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa 5ml môi trường MR - VP ở mỗi ống ( 1 ống đối chứng, 1 ống chứa mẫu ).
Dùng que cấy móc lấy khuẩn lạc vi sinh vật cần kiểm tra cho vào ống chứa mẫu.
Sau đó đem cả 2 ống nghiệm đi ủ ở 370C trong 24 – 48 h.
Sau thời gian ủ, đem nhỏ vào mỗi ống 5 giọt thuốc thử Methyl Red và quan sát hiện tượng.
Hình: phản ứng Methyl Red sau khi nhỏ thuốc thử
Kết quả:
Dung dịch trong ống chứa mẫu có màu cam (không có màu đỏ)à phản ứng âm tính
 Giải thích:
Thành phần chính của môi trường MR - VP là Glucose và Peptone, chỉ những vi sinh vật nào có khả năng oxi hóa Glucose để tạo ra năng lượng cho hoạt động sinh trưởng đồng thời tạo ra các sản phẩn biến dưỡng có tính acid mới làm acid hóa môi trường, do đó có làm đổi màu của Methyl Red, còn những vi sinh vật không tạo ra các sản phẩm biến dưỡng có tính acid ( môi trường vẫn là môi trường trung tính) sẽ không làm thay đổi màu của Methyl Red.
Nhận xét:
Trong ống chứa mẫu không có vi sinh vật có khả năng tạo ra các sản phẩm biến dưỡng có tính acid.
3. Thử nghiệm không sinh Acetoin ( thử nghiệm Voges – Proskauer (VP)
Nguyên tắc:
- Phản ứng thử VP dùng để phân biệt các vi sinh vật có khả năng sinh Acetoin ( môi trường trung tính).
- 2,3 Butanediol Acetoin Diacetyl. ( môi trường ở đây là Mt kiềm)
- Diacetyl + Guanidine Phức màu đỏ 
- Guadinine có trong môi trường pepton
- Thuốc thử : -Naphtho (6 giọt), NaOH 40% hoặc KOH 40% (2 giọt)
- Kết quả dương tính nếu dung dịch môi trường có màu đỏ à vi sinh vật có thể tạo ra Acetoin.
- Kết quả âm tính nếu dung dịch môi trường không đổi màu ban đầu. à không có vi sinh vật có thể tạo ra Acetoin.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa 5ml môi trường MR - VP ở mỗi ống ( 1 ống đối chứng, 1 ống chứa mẫu ).
Dùng que cấy móc lấy khuẩn lạc vi sinh vật cần kiểm tra cho vào ống chứa mẫu.
Sau đó đem cả 2 ống nghiệm đi ủ ở 370C trong 24 – 48 h.
Sau thời gian ủ, đem nhỏ vào mỗi ống 6 giọt thuốc thử -Naphthol và 2 giọt NaOH 40% hoặc KOH 40% , đợi 20 phút sau đó quan sát hiện tượng.
Kết quả:
Sau 48 giờ nhỏ 6 giọt α-naphthol sau đó nhỏ 2 giọt NaOH/KOH 40% lắc đều để yên trong 30 phút quan sát ta thấy có màu đỏ xuất hiện -> kết quả dương tính. 
Giải thích:
Vì sinh sinh vật trong ống chứa mẫu có khả năng sinh Acetoin nên tạo phức màu đỏ với Guanidine.
Nhận xét:
Trong mẫu có vi sinh vật có khả năng sản sinh acetoin.
4.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng Citrate
Nguyên tắc: Dùng để phân biệt những vi sinh vật có khả năng sử dụng Citrate như là nguồn cung cấp Carbon duy nhất. Những vi sinh vật này cũng đồng thời sử dụng muối amonium ( NH4+) làm nguồn cung cấp Nitơ duy nhất.
Chất chỉ thị : Bromothymol Blue có trong môi trường simmon citrate
Những vi sinh vật có khả năng sử dụng muối Citrate và Amonium sẽ tạo ra các sản phẩm biến dưỡng CO2, NH2, Na2CO3 làm kiềm hóa môi trường à chuyển chỉ thị Bromothymol Blue từ màu xanh lá cây sang xanh dương.
Kết quả dương tính nếu môi trường trong ống chứa mẫu chuyển từ xanh lá cây sang xanh dương
Kết quả âm tính nếu môi trường trong ống chứa mẫu không đổi màu
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa 5ml môi trường Cimon citrate ở mỗi ống ( 1 ống đối chứng, 1 ống chứa mẫu ), đổ môi trường thạch nghiêng.
Dùng que cấy móc lấy khuẩn lạc vi sinh vật cần kiểm tra cho vào ống chứa mẫu theo kiểu cấy ria.
Sau đó đem cả 2 ống nghiệm đi ủ ở 370C trong 24 – 48 h.
Sau đó,quan sát hiện tượng
Hình : Kết quả của phản ứng Thử nghiệm khả năng biến dưỡng Citrate
Kết quả:
Môi trường trong ống cấy mẫu có màu xanh dương à Kết quả dương tính.
Giải thích :
Do vi sinh vật sử dụng Citrate làm nguồn cung cấp carbon duy nhất à nên chúng sẽ sinh ra các sản phẩm làm kiềm hóa môi trường dẫn đến chất chỉ thị Brmothylmol Blue chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương.
Nhận xét :
Vi sinh vật có khả năng sử dụng muối Citrate và Amonium sẽ để tạo ra các sản phẩm biến dưỡng CO2, NH2, Na2CO3 nên làm kiềm hóa môi trường à chỉ thị Bromothymol Blue bị chuyển màu.
5.Kết luận
Sau 4 thử nghiệm kiểm tra E.coli:
Thử nghiệm khả năng sinh Indole : âm tính(-).
Thử nghiệm khả năng sinh Acid : âm tính(-).
Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP) : dương tính(+).
Thử nghiệm khả năng biến dưỡng Citrate: dương tính(+).
-> Kết luận vi sinh vật kiểm tra không phải là E.coli ( khác IMViC + + - -)
Vì E.coli là vi khuẩn có khả năng thủy phân Tryptophane sinh Indole, sản sinh ra các sản phẩm biến dưỡng có tính Acid nhưng không sinh ra Acetoin và không có khả năng sử dụng muối Citrate làm nguồn cung cấp Carbon duy nhất.
Bài 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CỦA VI SINH VẬT
I. Nguyên tắc:
- Chủng vi sinh vật vừa phân lập được nuôi cấy trên môi trường thích hợp để chúng phát triển thành khuẩn lạc.
- Các enzyme đặc trưng được chúng tiết ra môi trường xung quanh dưới dạng vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc gọi là vòng thủy phân.
- Căn cứ vào tỷ lệ đường kính vòng thủy phân và đường kính của khuẩn lạc để đánh giá khả năng hình thành enzyme của chủng vi sinh vật ( còn gọi là hoạt tính enzyme của chủng vi sinh vật đó.
II. Trình tự tiến hành:
Chuẩn bị:
2 đĩa petri đã được hấp tuyệt trùng.
1 bình tam giác chứa 40ml môi trường thử hoạt tính enzyme Amylase đã được hấp khử trùng.
Các ồng thạch nghiêng chứa 2 loại mốc : mốc đen Aspergillus niger, nấm mốc hoa cau Aspergillus oryzae.
Dụng cụ cấy, đèn cồn
Thuốc thử Lugol.
Tiến hành:
Đổ vào mỗi đĩa petri 15ml môi trường thử hoạt tính enzyme Amylase sau khi đã được hấp khử trùng vào ổn định nhiệt độ.
Dùng que cấy móc lấy vi sinh vật trong ống giống cấy vào trong môi trường thạch đĩa ( dùng để kiểm tra khả năng sinh enzyme ) thành từng 3 điểm theo kiểu hình tam giác đều.( 1 đĩa cấy mốc đen Aspergillus niger, 1 đĩa cấy mốc vàng hoa cau Aspergillus oryzae.
Lưu ý tránh tạp nhiễm trong thao tác cấy
Cấy xong đặt các đĩa petri vào tủ ấm ở 300 C trong thời gian 3 – 7 ngày.
Sau thời gian ủ, đổ dung dịch Lugol lên mặt thạch môi trường sau khi các khuẩn lạc vi sinh vật đã phát triển tương đối đầy đủ.
Enzyme amylase do nấm mốc tiết ra môi trường sẽ làm phân giải tinh bột ở phần xung quanh các khuẩn lạc tạo thành vòng thủy phân không màu, phần còn lại sẽ có màu xanh.
Lugol gặp tinh bột xuất hiện xanh đen, chỉ vùng vi sinh vật phát triển xuất hiện vòng trong suốt vì tinh bột bị phân hủy rồi.
Dùng thước đo đường kính vòng tan ( D) và đường kính khuẩn lạc (d).
Lập tỷ số D/d rồi so sánh tỷ số của 2 loại nấm mốc.
Hình: Đĩa cấy mốc vàng hoa cau Aspergillus Oryzae sau khi đã đổ dung dịch lugol
Hình: Đĩa cấy mốc đen Aspergillus niger sau khi đã đổ dung dịch lugol
Kết quả:
Nấm mốc đen Aspergillus niger : D1 =1,2cm , d1 = 2cm. (D/d = 0,6)
Nấm mốc vàng hoa cau Aspergillus oryzae : D2 = 2cm, d2 = 2,8cm. (D/d = 0,71)
Nhận xét:
Hoạt tính enzyme của mốc vàng hoa cau Aspergillus oryzae cao hơn so với hoạt tính enzyme của mốc đen Aspergillus niger.