Bài giảng Kỹ thuật PCR Polymerase Chain Reaction

Kỹ thuật PCR Polymerase Chain ReactionSự phát minh ra kỹ thuật PCRKỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymeraza được Kary Mullis phát minh vào năm 1983.Hai năm sau (1985), phát minh này được chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế.Bằng công trình này, Kary Mullis được tặng giải thưởng Nobel Hoá học năm 1993.“Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng được coi là một “bước ngoặt” hay “một kỹ thuật mang tính cách mạng” thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh học hiện đại “ .(J. Watson)	Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và ADN thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp yKhỏi niệmKỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép nhân nhanh một số lượng lớn một đoạn ADN nào đó trong ống nghiệm mà chỉ cần một số lượng mẫu ban đầu rất nhỏ. Nguyên tắc của kỹ thuật PCRKỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymeraza để nhân bản một đoạn ADN nhờ hai đoạn mồi oligonucleotít (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn ADNCác yêu cầu cần thiết cho PCRthermal cycler 2 mồi tổng hợp oligonucleotide (mỗi mồi có khoảng 20 nucleotide) (đầu 3' –OH tự do)ADN khuụnDNA polymerase chịu nhiệt (Tag-polymerase, có thể chịu được nhiệt độ tới 95 hoặc cao hơn) 4 loại nucleotide dNTP'sMg++, dung dịch đệm, pH, etc.Cỏc giai đoạn trong phản ứng PCRGiãn xoắn (denaturation): Hai sợi của chuỗi xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao (94-95oC). Gắn primer (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được giảm xuống (55-60oC) để các primer gắn vào các sợi ADN tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các bazơ nitơ.Kéo dài mạch bổ sung ADN (DNA extension): Phản ứng trùng hợp phân tử ADN được thực hiện nhờ enzym ADN polymeraza (65-75oC) để kéo dài mạch bổ sung theo nguyên tắc bổ trợ với sợi khuôn.Khuụn ADN được biến đổi thành 2 sợi đơn (94oC, 5 phỳt)Gắn primer vào chõn ADN (55-60 oC, 30 giõy)Tổng hợp chuỗi ADN mới (65-75oC, 2-5 phỳt)Biến đổi để tỏch thành đơn (94oC, 30 giõy)Chu trỡnh PCRChu kỳ phản ứng PCRChu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lập đi lập lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu được hàng triệu bản copy của một đoạn ADN nào đó, đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau.Hỗn hợp phản ứng PCRGĐ1GĐ2GĐ3Bắt đầu chu kỳ mới (2)Nhắc đi nhắc lại n chu kỳThời gian (phút)Nhiệt độ (oC)PCR-Chu kỳ 1PCR-Chu kỳ 2PCR-Chu kỳ 3Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR30 – 40 chu kỳ của 3 bướcBước 1: biến tínhBước 2: gắn primerBước 3: polymer hoá1 phút 94oC45 giây 54oC2 phút 72oCPrimerdNTPTốc độ tổng hợp ADN của phản ứng PCRSợi ADN khuụnĐoạn gen cần nhân bảnChu kỳ thứ 1Chu kỳ thứ 2Chu kỳ thứ 2Chu kỳ thứ 3Chu kỳ thứ 421= 2 bản sao22= 4 bản sao23= 8 bản sao24= 16 bản saoChu kỳ thứ 35235= 34 triệu bản saoSố phân tử ADN được tổng hợp tăng theo hàm số mũGiai đoạn 1: Giãn xoắn ADNTrình tự mục tiờu: thông thường  3000 bp (max. 10kb)Trình tự được xác định bởi một cặp mồi đặc hiệu, thường là một chuỗi oligonucleotít có khoảng 20 nucleotít (trình tự càng dài, tính đặc hiệu càng cao, thường  16 nucleotít)Nhiệt độ phản ứng được tăng lên 95oC để làm giãn xoắn sợi ADN khuụn mạch kép (kéo dài khoảng 0,5 đến 2 phút)Thời gian giai đoạn này càng dài, hiệu quả giãn xoắn càng cao nhưng làm giảm hoạt tính của enzym và có thể gây biến tính sợi khuôn. Nhiệt độ cao gây biến tính phân tử ADN và giãn xoắn hai sợi đơnSợi ADN ban đầu2 Sợi ADN sau khi giãn xoắn95oCMg2+Việc bổ sung Mg2+ vào phản ứng PCR giúp làm ổn định các mối tương tác giữa:oligonucleotít và sợi ADN khuônADN Polymeraza và sợi khuôn Giai đoạn 2: Gắn Primer (priming)Nhiệt độ giảm đi 15 – 25oCCác đoạn mồi (primer) gắn vào đầu 5’ của 2 sợi đơn ADNQuá trình kéo dài khoảng 0,5 - 2 phútThời gian càng ngắn, tính gắn đặc hiệu càng cao nhưng làm giảm hiệu suất của quá trình tổng hợp ADN ADN đíchprimerSợi ADN mớiSợi ADN mới Việc thiết kế mồi cần phải cú thụng tin về trỡnh tự ADN mục tiờu. Cỏc lưu ý khi thiết kế mồi cho PCR :  Độ dài: Quá ngắn ko đặc hiệu. Quá dài giảm hiệu quả lai Thường từ 18-25Mồi cú trỡnh tự phự hợp với khuụn (template), khoảng cỏch giữa cỏc mồi xuụi và ngược khụng dài quỏ 1 kb   Trỏnh hiện tựợng tự bắt cặp giữa cỏc mồi  mồi xuụi và ngược cần cú trỡnh tự khụng bổ sung với nhau Cú khoảng  45- 60% G/C   Cỏc mồi cú kớch thước ớt khỏc nhau, cú Tm gần giống nhau  tăng hiệu quả của PCRThiết kế primer cho PCRCỏc yếu tố ảnh hưởng Tm của primer:Chiều dài của primerHàm lượng G/C Đối với cỏc primers cú 15 - 26 nucleotides, tớnh Tm theo cụng thức Wallace (1989): Tm = [2(A+T) + 4(G+C)] ° CĐối với mồi > 20 – 35 bazơ thỡ nhiệt độ gắn mồi tính như sau:Tm = 22 + 1,46 {2 (G + C) + (A + T)}0C Hỡnh. Sự biến tớnh bởi nhiệt của ADNTm phụ thuộc:	Hàm lượng (G+C) của DNA. 	Bản chất của dung môi. 	Bản chất của DNA. Hỡnh. Mối quan hệ của Tm với hàm lượng G +C  Cặp mồi để nhõn gen chống bệnh đạo ụn (nằm trờn NST 12) ở lỳa nhờ PCR:  CAGCTGTTCAGTCGTTTGCAGCTGTTC 27 NUCLEOTIDATACCGTTATGGGCATTAAGGAAT 24 NUCLEOTIDCặp mồi để nhõn gen chống bệnh bạc lỏ ở lỳa Xa21 (gen khỏng bạc lỏ, nằm trờn nST 21-pTA-248) nhờ PCR:AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGAG 24 NUCLEOTIDAGCGCGGTGTAATCGAAAGATGAAA 25 NUCLEOTIDVớ dụ:Giai đoạn 3: polymer hoá phân tử ADN(DNA Polymerization)Trước đây, dùng DNA polymerase (E.coli polymerase I) và T4 polymerase để kéo dài primerCác DNA polymerases này có tính chính xác cao do có hoạt tính proof-reading exonuclease (theo chiều 3'--->5').Hạn chế:Nhiệt độ làm việc thích hợp là 37oC không thích hợp cho quá trỡnh bắt cặp của mồi (mis-priming) (i.e. primers gắn vào trỡnh tự ADN sai). Nhiệt độ cao dùng để giãn xoắn ADN sau mỗi chu kỳ lam biến tính enzyme  phải bổ xung enzyme mới sau mỗi chu kỳ ko tự động hóa được. phát hiện ra Taq polymeraza của vi khuẩn Thermus aquaticus là loài vi khuẩn sống ở suối nước nóng Trọng lượng phân tử 94kD. Hoạt động tối ưu ở 75-80oC. nhưng vẫn bền vững ở nhiệt độ cao hơn (i.e. 90-95oC). Taq cho phép mồi bắt cặp với sợi khuôn và tiến hành tổng hợp kéo dài chuỗi ở nhiệt độ cao mà không bị biến tínhTaq polymerazaGiai đoạn 3: polymer hoá phân tử ADN(DNA Polymerization)Do Taq polymeraza hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 75oC nhiệt độ của phản ứng ở giai đoạn này thường được nâng lên 72-75oC.Enzym ADN polymeraza nhận ra các đoạn mồi đã được gắn vào sợi khuôn và xúc tác cho phản ứng trùng hợp (polymer hoá) phân tử ADN mới theo nguyên tắc bổ sung các các bazơ nitơ, với nguồn bazơ nitơ tự do là dNTP. Với sợi khuôn là sợi đơn đã được giãn xoắn ở giai đoạn 1.Tốc độ trùng hợp đạt khoảng 150 nucleotít / giâyMột số nhược điểm của Taq polymerazaThiếu chức năng sửa chữa lỗi trong quá trình tổng hợp phân tử ADN mớiCó thể lắp ghép nhầm dNTP vào sợi khuôn không theo nguyên tắc bổ trợ (xác suất thấp), dẫn đến có lỗi về trình tự trong một số trường hợp.Một số DNA polymerases chịu nhiệt khác Stoffel fragment: là tag polymerase (61kD) nhưng có thể hoạt động ở nhiệt độ cao gấp 2 lần so với tag tự nhiênMột số enzym mới được phát triển gần đây, như Tli- và Pfu- polymeraza, có độ chính xác cao hơn nhưng tốc độ tổng hợp ADN và hiệu suất phản ứng PCR không cao bằng Taq-polymeraza.Recombinant Taq polymerasecó tính đồng nhất cao độ phân giải cao hơn.Các thao tác sau PCRSau khi chạy PCR, sản phẩm được nhận biết bằng cách chạy điện di trên gelCỏc yếu tố khỏc ảnh hưởng đến hiệu quả nhõn PCRĐộ tinh sạch của ADN khuụnHoạt động của Enzyme ADN polymerase (Enzyme Th.polymerase hoạt động như enzyme phiờn mó ngược, Tag polymerase xỳc tỏc phản ứng khuyờch đại ADN)Nồng độ cỏc loại nucleotidNồng độ cỏc dung dịch đệm Mg++, MgCl2...ưu điểm nổi bật của kỹ thuật PCR-Có thể sử dụng trực tiếp ADN vừa chiết xuất, không cần tinh chế.-Chuỗi ADN làm khuôn không cần tách chiết, và tính đặc hiệu của phản ứng do các oligo nucleotid làm mồi quyết định. Các ứng dụng chủ yếu của PCRSử dụng PCR để tách dòng các đoạn ADN chưa biết trật tự nucleotít.Chuẩn đoán nhanh, nhạy tất cả các bệnh di truyền và nhiễm trùng (ung thư, virus, vi khuẩn, nấm..)Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm qua phát hiện các đoạn gen đặc trưng của nhiễm sắc thể giới tính.Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gen, xác định tính đa hình ADN, làm cơ sở cho việc phân tích các chỉ thị phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật), phát hiện các kiểu đột biến.Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh , Xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hỡnh sự từ những dấu vết rất nhỏ: giọt máu, nước dãi, sợ tócKhôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục triệu năm.Ứng dụng PCR trong tỏch/nhõn dũng genỨng dụng PCR trong chẩn đoỏn bệnh (HIV)Ứng dụng PCR trong chẩn đoỏn bệnh hồng cầu hỡnh lưỡi liềmỨng dụng PCR trong giám định hình sự