Bài giảng môn Sinh học - Enzyme

EnzymeKhởi đầu từ nghiên cứu của Pasteur về quá trình lên men đường thành rượu (fermentation từ chữ Latin là fermentum)Về sau khái niệm này được thống nhất thành từ enzyme. Trong tiếng Hy lạp en là bên trong, zym là sự lên men)Đặc điểm cơ bản của enzyme là có tính đặc hiệu cao và hiệu quả xúc tác lớn (có thể đạt đến 1016 lần so với không có enzyme)Enzyme có mặt hầu hết trong tất cả các tế bào sốngĐa số các enzyme có bản chất protein và hoạt tính xúc tác của enzyme phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử protein (1,2,3,4)Tốc độ của một vài phản ứng có enzyme xúc tácEnzymeEnzyme có trọng lượng phân tử biến đổi rất lớn (hàng triệu Dalton)Enzyme có thể có hoạt tính độc lập hay có sự tạo phức với các cộng tố (cofactor) kim loại hoặc phức chất hữu cơEnzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong y học, công nghiệp chế biến, . (enzymology)Tính chất của enzymeKhông tham gia vào thành phần cuối của phản ứngChỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzymeKhông làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc độ của phản ứngTính chất sinh học của enzyme Theo cấu trúc hóa học thì tất cả enzyme là protein Có hiệu suất xúc tác sinh học cao hơn gấp nhiều lần xúc tác hóa học, tuy nhiên vận tốc có thể tăng khi có xúc tác hóa học Enzyme có tính đặc hiệu cao và có tính chọn lọc đối với cơ chất Thực hiện sứ mệnh điều phối tất cả các quá trình trao đổi chất của cơ thể Trong các phản ứng enzyme hầu như kết quả cho ra 100% sản phẩmBản chất hóa học của enzymeCó tính chất lý hóa học của proteinĐa số có dạng hình cầu và không đi qua được màng bán thấm do kích thước lớnTan tốt trong nước và trong dung dịch muối loãng (buffer)Cũng như protein enzyme không bền với nhiệt độ. Bị gây biến tính bởi acid, base mạnh hay muối kim loại nặngBản chất hóa học enzymeEnyme là những protein đơn giản (enzyme 1 cấu tử): chỉ cấu tạo bởi các L-amino acid, trung tâm hoạt động là các nhóm chức có trong phân tử của amino acidEnzyme phức tạp (enzyme 2 cấu tử): ngoài L-amino acid còn có nhóm ngoại (prosthetic). Trong enzyme phức tạp, phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải protein có thể tách ra và tồn tại độc lập gọi là coenzyme (vitamin). Khi kết hợp chặt với phần protein gọi là nhóm ngoạiĐa số các coenzyme là chất cho hoặc nhận điện tửBản chất hóa học của enzymeCoenzyme trực tiếp tham gia trong phản ứng xúc tác và giữa vai trò quyết định kiểu của phản ứng xúc tácCoenzyme là cầu nối giữa phần protein của enzyme và giúp ổn định phần apoenzymeNgược lại apoenzyme có tác dụng nâng cao hiệu lực xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzymeTrung tâm hoạt động của enzymeTrong phản ứng xúc tác của enzyme chỉ có một phần nhỏ của phân tử enzyme tham gia trực tiếp kết hợp đặc hiệu với cơ chất gọi là trung tâm hoạt động của enzymeMột enzyme có thể có nhiều hơn 1 trung tâm hoạt động (a.s)Trung tâm hoạt động có thể được chia làm 2 bộ phận:Tâm xúc tác: tham gia kết hợp trực tiếp với cơ chấtMiền tiếp xúc: gắn cơ chất lên vị trí tác dụngTrung tâm hoạt động có kích thước không lớn so với toàn bộ enzymeSơ đồ trung tâm hoạt động của enzyme theo DixonCác nhóm chức hoạt độngMạch polypeptideCơ chấtTrung tâm hoạt động của enzymeCơ chế hoạt động của enzymeMô hình chìa khóa và ổ khóa: trung tâm hoạt động phải có cấu trúc tương ứng với cấu trúc của cơ chất (khớp với nhau như chìa và ổ khóa)Sơ đồ cơ chế hoạt động của enzyme theo FischerPhức hợp enzyme – cơ chất [ES]Cơ chế hoạt động của enzymeThuyết tiếp xúc cảm ứng: (theo Kosland) sự tương tác cảm ứng về cấu trúc không gian tạo nên phức hợp enzyme cơ chấtSơ đồ thuyết tiếp xúc cảm ứng theo KoslandCơ chế tác dụng của enzymeNăng lượng hoạt hóa (Ea): là năng lượng cần cung cấp để phân tử đạt tới trạng thái hoạt hóa. Ex. Xăng có khả năng bốc cháy nhưng cần lửa mồiPhản ứng phân hủy H2O2Không có xúc tác Ea = 18 Kcal/molCó xúc tác platin Ea = 11,8 Kcal/molXúc tác bởi enzyme catalase Ea = 5,5 Kcal/molCơ chế tác dụng của enzymeCơ chế tổng quát:Cơ chất phải được gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất [ES]Với tác dụng của enzyme, hoạt tính của cơ chất tăng lên rõ rệt và chỉ cần 1 năng lượng hoạt hóa nhỏ thì sẽ tạo thành sản phẩmCơ chế tác dụng theo Michaelis-MentenTạo nhanh phức ES, phức này không bền, phức được tạo nên do các liên kết hóa họcDưới tác dụng của enzyme, cơ chất được biến đổi thành sản phẩmSau khi tạo sản phẩm (P), enzyme được giải phóng ra và trở về trạng thái ban đầuPhản ứng tổng quát:Cơ chế xúc tác của một số enzymeCholinesterase: 	xúc tác sự thủy phân xung động thần kinh	có trung tâm hoạt động là 4 amino acidCơ chế xúc tác của một vài enzymePiridoxal-Phosphate (B6)Base-SchiffPyridoxaminphosphate keto acidBước 1Base-SchiffPyridoxalphosphate a-amino acidBước 2Coenzyme là vitaminAdenine Nucleotide Coenzymespyridine dinucleotides (NADH, NADPH)flavin mono- and dinucleotides (FMN, FADH)coenzyme AĐặc điểm chung của các coenzyme này là nhóm adenine nucleotide liên kết với enzymeCoenzyme A Có nhóm hoạt động là – SH, do đó còn có tên gọi là CoASH Tham gia trong hệ enzyme pyruvate dehydrogenaseNicotinamide CoenzymeNAD và NADP: tham gia vận chuyển điện tửFlavin adenine dinucleotideFAD: phản ứng oxy hóa khử vận chuyển điện tửCoenzyme có chứa kim loạiTham gia phản ứng vận chuyển điện tử, vận chuyển oxyĐiển hình là hemeCoenzyme có chứa kim loạiIon kim loại (cofactor)Tên enzymeFe2+ hoặc Fe3+  Cu2+Zn2+  Mg2+ Mn2+K+Ni2+MoSeCytochrome oxidaseCatalasePeroxidaseCytochrome oxidaseDNA polymeraseCarbonic anhydraseAlcohol dehydrogenaseHexokinaseGlucose-6-phosphataseArginasePyruvate kinaseUreaseNitrate reductaseGlutathione peroxidaseMột vài cộng tố kim loại của enzymeCoenzymeNhóm vận chuyểnTên enyzmeThiamine pyrophosphate (TPP)Flavin adenine dinucleotide (FAD)Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)Coenyzme A (CoA)Pyridoxal phosphate5’-Deoxyadenosylcobalamin (Vitamin B12)Biotin (Biocytin)Tetrahydrofolate (THF)AldehydeNguyên tử hydroHydride ion (H-)Nhóm acylNhóm aminoNguyên tử H và nhóm alkyl CO2Các nhóm có chứa C khácPyruvate dehydrogenaseSuccinate dehydrogenaseAlcohol dehydrogenaseAcetyl-CoA carboxylaseAspartate aminotransferaseMethylmalonyl-CoA mutasePropionyl-CoA carboxylaseThymidylate synthaseMột vài coenzyme của enzymeChlorophyllChứa phức Fe-S và phylloquinoneGlutathion (Glut-SH)Tham gia phản ứng oxy hóa khử, phản ứng khử độcTính đặc hiệu trong xúc tác của enzymeEnzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối: chỉ có tác dụng lên một cơ chất nhất địnhEnzyme có tính đặc hiệu tương đốiEnzyme có tính đặc hiệu nhóm: có tác dụng lên nhiều chất có cấu tạo tương tự. Điển hình là các enzyme thủy phânEnzyme đặc hiệu lập thể: Chỉ tác dụng lên những đồng phân lập thể nhất địnhEnzyme có tính đặc hiệu kiểu phản ứng: chỉ có tác dụng trên một phản ứng nhất địnhCác yếu tố ảnh hưởng lên hoạt động xúc tác của enzymeNồng độ enzymeNồng độ cơ chấtNhiệt độpHChất hoạt hóaChất ức chếẢnh hưởng của nồng độ enzyme và nồng độ cơ chấtKhi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzymeẢnh hưởng của nồng độ cơ chất	+ Phương trình Michaelis – Menten (tham khảo)	V0 = Vmax [S]/(Km + [S])Km đặc trưng cho ái lực của [E] với [S]. Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của [E] với [S] càng lớn, nghĩa là vận tốc của [E] càng lớn+ Khi S>>Km, phản ứng đạt giá trị cực đại, không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất tăng thêm+ Khi S = Km: vận tốc phản ứng bằng ½ giá trị cực đạiẢnh hưởng của nồng độ cơ chấtĐồ thị tổng quát biểu diễn tốc độ phản ứng của enzyme vào nồng độ cơ chấtPhương trình xác định giá trị Km và VmaxPhương trình này có dạng y = ax + bẢnh hưởng của nhiệt độThường vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, tăng 10oC thì vận tốc tăng 1,4 – 2 lần. Quá 70oC, đa số enzyme mất hoạt tínhNhiệt mà enzyme đạt vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích (khác nhau tùy enzyme)Nhiệt độ tối thích của enzyme tv (50-60oC) > enzyme đv (40-50oC)Một số enzyme có khả năng chịu nhiệt cao: papainNhiệt độ thấp ức chế hoạt tính E nhưng E có khả năng phục hồi hoạt tính trở lại khi đưa về nhiệt độ thích hợp (ưng dụng để bảo quản E)Tương tác với các yếu tố khác: bản chất enzyme, pH môi trường, nồng độ cơ chất,Ảnh hưởng của nhiệt độHoạt tính enzyme [%]Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzymeẢnh hưởng của pHEnzyme hoạt động mạnh nhất ở 1 giá trị pH nhất định gọi là pH tối thích (tùy thuộc bản chất protein)Enzyme nhạy cảm với sự thay đổi pH, thường tối thích ở khoảng acid yếu, trung tính hay kiềm yếu. Ex. Amylase khoảng 5, protease của dứa khoảng 6pH quá cao hoặc quá thấp đều bất lợi vì ảnh hưởng lên sự phân cực của cả enzyme và cơ chấtCác chất hoạt hóaChất hoạt hóa là những chất làm cho enzyme không hoạt động trở nên hoạt động hoặc từ hoạt động yếu sang hoạt động mạnhChất hoạt hóa có thể là:	+ Chất hữu cơ phức tạp như vitamin, coenzyme	+ Các ion kim loại hoạt động mạnh (Ca++, K+, Na+, Mg++), phi kim mạnh Cl-, Br-, I-Chất kìm hãmLà những chất có khả năng làm giảm hoặc chấm dứt hoàn toàn hoạt tính của enzymeKìm hãm cạnh tranh: xảy ra đối với enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối. Chất kìm hãm có cấu trúc giống với cơ chất và chiếm chổ của cơ chất thậtSơ đồ biểu diễn cơ chế hoạt động của chất kìm hãmPhức hợp [EI] không hoạt độngPhức hợp [ES] hoạt độngChất kìm hãm không cạnh tranhChất kìm hãm không cạnh tranh không liên kết tại trung tâm hoạt động của enzyme mà ở một vị trí khác trên enzyme làm thay đổi cấu trúc của enzyme dẫn đến việc giảm hoạt tính xúc tác của nó.Sự phân bố enzyme trong tế bàoEnzyme có mặt khặp mọi mô, mọi tế bàoCó tính chuyên biệt cho từng loại môNhân tế bào chứa các enzyme liên quan đến biến dưỡng nucleic acidTy thể chứa hệ enzyme liên quan đến quá trình hô hấpRibosome chứa hệ enzyme tổng hợp proteinLục lạp chứa enzyme liên quan đến quang hợp, biến dưỡng chất béoPhân loại enzymeTên gọi của enzyme được thống nhất tại Hội nghị sinh hóa quốc tế lần thứ V (1961)Tên enzyme gồm có 2 phần:	+ Phần thứ nhất chỉ cơ chất	+ Phần thứ 2 chỉ tên kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác + đuôi „ase“. Hai phần được cách nhau bằng dấu gạch ngangEx. Enzyme xúc tác phản ứng chuyển nhóm amine gọi là amino-transferase; enzyme loại nhóm CO2 ra khỏi phân tử Tyr gọi là enzyme tyrosine-decarboxylaseBên cạnh hệ thống phân loại quốc tế người ta vẫn dùng tên cũ trước đây như amylase (Ptyalin), urease, pepsin, trypsin, .Phân loại enzyme (EC)Enzyme được phân loại thành 6 nhóm chính: OxidoreductaseTransferaseHydrolaseLyaseIsomeraseLigasePhân loại enzyme (EC?)E.C. NumberTên và các nhóm phụ xúc tác11.11.1.11.1.31.21.2.31.31.3.1Oxidoreductases (tham gia xúc tác cho các phản ứng oxy hóa - khử)chất cho CH – OHchất nhận NAD hoặc NADPchất nhận O2chất cho COchất nhận O2chất cho CH – CHchất nhận NAD hoặc NADPVí dụ về sự phân loại của enzyme glucoseoxydaseTên theo hệ thống phân loại: E.C 1.1.3.4 có nghĩa:	1: chỉ nhóm chính (oxidoreductase)	1: chỉ nhóm phụ	3: chỉ nhóm phụ thứ 3	4: số thứ tự của enzyme trong nhóm phụ thứ 3OxidoreductaseLà nhóm xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khửNếu chất chuyển hay chất nhận rõ ràng thì gọi tên theo chúng. Ex. Dehydrogenase (NAD, FAD, FMN,) oxydase (nhận hydro), oxygenase (kết hợp trực tiếp với oxy)Nếu chất cho hydro không rõ ràng thì gọi là reductaseCác enzyme thường gặp trong nhóm này là: dehydrogenase, oxydase, peroxidase, catalase,OxidoreductaseTransferaseLà nhóm enzyme xúc tác chuyển nhóm, chuyển gốc từ chất này sang chất khácPhản ứng tổng quát là 	AX + B	  	A + BXCách gọi tên: theo chất nhận nhóm chuyển vận transferaseE.C. NumberTên và các nhóm phụ xúc tác22.12.1.12.1.22.1.32.22.32.42.62.6.12.72.7.12.8Transferases (transfer of functional groups)Transferring C-1 groupsMethyltransferasesHydroxymethyltransferases and formyltransferasesCarboxyltransferases and carbamoyltransferasesTransferring aldehydic or ketonic residuesAcyltransferasesGlycosyltransferasesTransferring N-containing groupsAminotransferasesTransferring P-containing groupsWith an alcohol group as acceptorNhóm transferase được chia ra làm 7 nhóm phụ2.1	chuyển nhóm carbon đơn như methyl, carboxyl,2.2	chuyển nhóm aldehyde hoặc cetone, có 2 enzyme điển hình là 	transketolase (chuyển 2C) và transaldolase (chuyển 3C)2.3 	chuyển gốc acyl, acyltransferase2.4	chuyển gốc glycosyl, glycosyl transferase2.6	chuyển nhóm đạm, aminotransferase2.7 	chuyển nhóm phosphate, phosphotransferase2.8	chuyển nhóm lưu huỳnh, sulphurtransferaseHydrolaseLà nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ với sự tham gia của nướcPhản ứng tổng quát	XY + H2O 		XOH + YHCách gọi tên: tên của cơ chất được tách ra hydrolaseNhóm này được chia ra 11 nhóm phụCác enzyme thường gặp là esterase, phosphatase, nuclease, peptidase, lipaseLyaseLà enzyme phân cắt chất hữu cơ không có sự tham gia của nướcĐược chia làm 7 nhóm phụCách gọi tên: tên cơ chất + tên của nhóm được tách ra + lyase. Ex. Aspactate ammonia lyaseCác enzyme thường gặp: decarboxylase, aldolase, hydratase,IsomeraseLà nhóm enzyme xúc tác cho chuyển hóa giữa 2 dạng đồng phân D và L, cis và trans, aldose và ketoseCác enzyme thường gặp là epimerase, mutase, isomeraseSynthetase (ligase)Là nhóm enzyme xúc tác tổng hợp chất hữu cơ và cần năng lượng từ ATP, GTP,Được chia thành 4 phụ nhóm tạo các liên kết: - C – O -, - C – S-, - C – N -, - C – C – Cách gọi tên: Tên cơ chất + ligase (hay synthetase); ex. Glutamin synthetasePhương pháp nghiên cứu enzymeXác định hoạt độ (độ hoạt động) của enzyme	+ Độ hoạt động của enzyme là lượng enzyme được tính bằng số đơn vị qui ước có trong một đơn vị khối lượng hay thể tích nhất định trong chế phẩm enzyme	+ Lượng enzyme thường được ước lượng thông qua lượng cơ chất mất đi hoặc sản phẩm tạo thành của phản ứng ở điều kiện chuẩn	+ Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 µM cơ chất trong 1 phút ở điều kiện chuẩn	+ Đơn vị hoạt tính của enzyme được gọi là Katal (Kat) 1 Kat tương ứng với lượng chất xúc tác có thể chuyển hóa 1 mol cơ chất thành sản phẩm trong 1 giâyXác định hoạt độ của enzyme1 Kat = 1mol cơ chất/giây = 60 mol/phút =.Số chuyển hóa = mol cơ chất đã chuyển hóa / phútĐơn vị enzyme quốc tế = hoạt tính xúc tác sự chuyển hóa của 1 µmol cơ chất trong 1 phútHoạt tính riêng = số Katal / 1 kg protein hoạt độngHoạt tính molar = số Katal / mol enzymeĐộ hoạt động riêng là độ hoạt động ứng với 1 mg protein enzymeCác phương pháp để xác định cơ chất mất đi hoặc sản phẩm tạo thành bằng các phương pháp hóa học, quang phổ, sắc ký, điện di, so màu, Xác định hoạt độ của enzymeMức độ hoạt động của enzyme còn được thể hiện ở số vòng quay (t.o)Số vòng quay (kcat) được định nghĩa là số phân tử cơ chất được biến đổi thành sản phẩm bởi một phân tử E ứng với một khoảng thời gian nhất định trong điều kiện bảo hòa cơ chất Như vậy số vòng quay thể hiện hoạt tính phân tử của E và cho biết hoạt độ xúc tác tối đa của E Tên enzymeSố vòng quay (kcat/s)CatalaseCarbonic anhydraseAcetylcholinesterasePenicillinaseLactate dehydrogenaseChymotrypsinDNA polymerase ILysozym 40 000 0001 000 00014 0002 0001 000100150,5Phương pháp tách và làm sạch enzymeBiện pháp cơ học: cối chày sứ + chất tạo ma sát (cát, hạt ceramide)Biện pháp hóa học: dung môi hữu cơPhương pháp vật lý: sóng siêu âmChiết enzyme với dung dịch muối loãng (dung dịch đệm)Thu nhận enzyme bằng các biện pháp điều chỉnh pH, nhiệt độ, sắc ký, điện diLàm sạch bằng lọc gel Sephadex, HPLC,..Ứng dụng của enzymeCho các quá trình lên men: chè, thuốc lá, ca cao, lợi dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệuSử dụng enzyme chiết tách từ động vật, thực vật, vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệpEnzyme amylase trong lên men bánh mì, lên men rượu biaBổ sung enzyme để dễ tiêu hóa (các sản phẩm cho trẻ em)Ứng dụng trong y khoa: pepsin làm thuốc trợ tiêu hóaTrong sản xuất nông nghiệp: cellulase để phân hủy rơm rạ, bổ sung trong sản xuất thức ăn gia súcHệ enzyme amylase (Ptyalin)Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolaseCơ chất tác dụng là tinh bột và glycogenSản phẩm của sự thủy phân là dextrin, maltose, glucoseNguồn gốc: nước bọt, dịch tiêu hóa ở người và động vật, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩnCác dạng chính: -, - và -amylasepH tối thích cho -amylase ở mầm lúa nước là 5,3 (thực hành pH = 5,0)Nhiệt độ tối thích 58 – 60oC (thực hành to = 50oC)-amylase được hoạt hóa bởi Ca2+ và Cl-. Bị ức chế bởi Cu2+, Ag+ và Hg2+Hệ enzyme amylase (Ptyalin)Khảo sát hoạt tính tương đối của hệ enzyme amylase trích từ mầm lúa nướcKhảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (tinh bột) lên tốc độ thủy giải của enzyme amylaseKhảo sát ảnh hưởng của pH (2 – 8) lên tốc độ thủy giải của enzyme amylaseKhảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa (CaCl2) và chất ức chế (CuSO4) lên tốc độ thủy giải của enzyme amylaseĐồ thị biểu diễn hoạt tính tương đối của enzyme amylase từ mầm lúa nước khi nồng độ cơ chất không đổiTheo lý thuyếtThực tếĐồ thị biểu diễn ảnh hưởng (tương quan) của nồng độ cơ chất đến thời gian thủy phân khi thể tích enzyme amylase không đổiTheo lý thuyếtThực tếĐồ thị biểu diễn ảnh hưởng (tương quan) của pH đến thời gian thủy phân khi thể tích enzyme amylase và nồng độ cơ chất không đổi