Bài giảng môn Sinh học - Phương Pháp PCR

Phương Pháp PCRNhóm IV – DH06BQLời Nói ĐầuViệc nghiên cứu di truyền học vi sinh vật đã đóng góp đáng kể trong thực tiễn, góp phần đẩy mạnh việc sản xuất ở quy mô công nghiệp, hàng loạt các sản phẩm ở quy mô công nghiệp và nhiều sản phẩm sinh học có giá trị như: chất kháng sinh, vitamin, ezyme, các acid amin.Với khoa học kỹ thuật hiện đại, đã ứng dụng di truyền vi khuẩn trong lĩnh vực chuẩn đoán như: ADN probe, kỹ thuật PCR, ELISA, Chúng ta sẽ tìm hiểu về kỹ thuật PCRTỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PCRKhái niệmNguyên tắc của phản ứng PCRCác yếu tố trong phản ứng PCRƯu và nhược điểm của phương pháp PCRỨng dụng của PCR Khái NiệmPCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men.Kỹ thuật này do KARL MULLIS phát minh vào năm 1985. Ông đạt giải nôbel hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này.Ý kiến của Mullis là phát triển một một quy trình mà ADN có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme ADN Polymerase. Trở vềNguyên Tắc Phản Ứng PCRPhản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp ADN. Là phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép. Phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử thường là 94-950C trong vòng 30-60 giây. Mạch đôi ADN tách ra dạng mạch đơn.Bước 1:(Bước tiến hành, denaturation) Bước 2:(Bước lai, arealation) Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C, tùy thuộc Tm của mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây. Bước 3:(Bước tổng hợp, elongation)Nhiệt độ được nâng lên 720C giúp cho ADN polymerase (vốn là Polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Tiếp>>Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles)Giai đoạn biến tính: 920C-980C                           Tiếp>>Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân.Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Tổng số ADN khuếch đại sau phản ứng PCR được tính theo công thức:Tổng số ADN khuếch đại = m x 2n (với m là số bản sao ban đầu của ADN mẫu; n là số chu kỳ. Trở vềCác Yếu Tố Trong Phản Ứng PCRTaq polymerase Các nucleotidePrimer (mồi)Dung dịch đệm ADN khuônSố chu kỳ phản ứngNhiệt độ và pH Trở vềƯu Và Nhược Điểm Của Phương Pháp PCRƯu điểm:Thời gian thực hiện nhanh (chỉ cần 3h để khuếch đại một trình tự ADN được quan tâm)Đơn giản và ít tốn kémĐộ tinh sạch của mẫu không cần caoNhược điểm:Trong thực nghiệm, kích thước của các đoạn cấn khuếch đại giới hạn đầu tiênSự ngoại nhiễm là vấn đề đặt ra lớn nhất đối với PCRSự sai sót do Taq Polymerase gây raTrở vềỨng DụngY khoa: dùng để chuẩn đoán bệnh với tác nhân là virus, vi khuẩn.Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định yếu tố gây bệnh trong cây trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo như việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactinThực phẩm: xác định tác nhân gây bệnh do vi khuẩn, virus có trong mẫu thực phẩm gây ngộ độc thực phẩm. Dùng để chuẩn đoán thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay sản phẩm chuyển đổi gen.Trở vềỨng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán viêm não, viêm màng nãoXét nghiệm trong chuẩn đoán virus gây viêm gan siêu vi B và CSử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh nhóm vi khuẩn gây bệnh trong dịch não tủy Phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (HIV, HBV, HCV, M.tuberculosis, leptospira, H.pylory...) có trong các loại bệnh phẩm lâm sàng khác nhau Chẩn đoán các bệnh ung thư : vú, leukeumia và các loại ung thư khác Phát hiện định danh về huyết thống, dấu vân tay, định typ mô học, pháp y... Tiếp>>Shigella spp là một loại vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm có mặt trong thực phẩm có thể gây bệnh với một lượng nhỏ từ 10 đến 20 tế bào. Phương pháp truyền thống hiện nay để phát hiện shigella từ thực phẩm dựa vào các kỹ thuật nuôi cấy, phân lập vi sinh, các thử nghiệm sinh hóa, mất nhiều ngày để cho kết quả. Do vậy, một quy trình PCR để pháy hiện shigella có tính đặc hiệu cao và cho kết quả nhanh hơn đã được phát triển. Qui trình này được tiến hành với cặp mồi SHIG khuếch đại cho một trình tự 320bp trên plasmid xâm nhiễm đặc hiệu cho cho shigella spp. Và cặp mồi 16S rARN hiện diện trong mọi vi khuẩn. Phương pháp này cho phép phát hiện shigella spp. ở mức 10CFU/25g thực phẩm sau 12-24h tăng sinh, cho key61 quả sau 24h, ngắn hơn rất nhiều lần so với việc phát hiện bằng phương pháp truyền thống Trở vềTới nay, ở Việt Nam, việc chẩn đoán viêm màng mủ não chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp soi, nuôi cấy và định danh. Các bác sĩ vẫn phải dựa vào các triệu chứng lâm sàng, sinh hóa để chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, dù riêng rẻ hay phối hợp, các biện pháp này đều không thể chẩn đoán bệnh nhanh, kịp thời và chính xác. Thay vì phải mất từ 12 đến 24 giờ để chẩn đoán bệnh thì nay, chỉ cần chạy PCR với một lượng nhỏ mẫu dịch não, trong vòng 6 giờ là đã có kết quả. Trở về