Bài giảng nhập môn công nghệ sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTHÁI NGUYÊN 2008Bài giảng Nhập mônCÔNG NGHỆ SINH HỌCChương 2KỸ THUẬT DI TRUYỀNNỘI DUNG	- Mở đầu	- Khái niệm về ADN tái tổ hợp	- Các enzym chính sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp	- Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp	- Các hệ thống tế bào chủ	- Nhân dòng gen	- Kỹ thuật PCR	- Xác định trình tự gen1. MỞ ĐẦU	CNSH hiện đại khác với CNSH truyền thống ở chỗ lấy kỹ thuật di truyền (genetic engineering) làm trung tâm	Kỹ thuật di truyền hay công nghệ gen (gene technology) bao gồm các kỹ thuật thực hiện trên axit nucleic, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen, hoặc tạo ra gen mới, từ đó tạo ra sản phẩm mới hoặc các cơ thể mới	Để có thể tiến hành được kỹ thuật di truyền hay các thao tác gen, mọi thực nghiệm đều phải sử dụng ADN tái tổ hợp. Do đó, công nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant DNA technology) là chìa khóa của kỹ thuật di truyền	Năm 1972: CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP ra đời. Nhà sinh hóa tại Stanford, Paul Berg, đã nối hai đoạn DNA đầu bằng cắt từ virus SV 40 và vi khuẩn E. coli lại với nhau, tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp. Berg đã được nhận giải Nobel Hóa học vào năm 1980 cùng với Walter Gilbert và Fred Sanger.	Năm 1972, tại một hội nghị khoa học ở Hawaii, Cohen nghe Boyer trình bày thí nghiệm với EcoE1 của ông và kết luận của Boyer rằng các đầu dính của DNA có thể được nối lại với nhau hoặc có thể “bị cắt” bằng DNA ligase. Sau đó, hai ông đã gặp nhau và thảo luận về phương pháp kết hợp phân lập plasmid với cắt nối DNA. Họ đã đưa ra ý tưởng về việc chèn đoạn DNA mong muốn vào các plasmid của vi khuẩn để sau đó có thể sản xuất lượng lớn các protein đặc biệt – chất cơ bản của công nghiệp công nghệ sinh học	Năm 1976, NHỮNG BƯỚC ĐỘT PHÁ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC. Nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử, các tế bào được sử dụng như các nhà máy nhằm sản xuất các hormone và protein với quy mô công nghiệp. Các sản phẩm này chính là các “dược phẩm sinh học” có tiềm năng thương mại rất lớn. Robert Swanson – một nhà đầu tư táo bạo ở thung lũng Silicon, và Herb Boyer đã cùng nhau thành lập hãng Genetech, Inc với mục tiêu tách dòng insulin của người. Genetech được đưa lên sàn giao dịch vào ngày 14/10/1980, bán ra tới 1 triệu cổ phiếu với mệnh giá 35 $/cổ phiếu- và thu tới 35 triệu $ chỉ trong một buổi chiều. Tới cuối phiên giao dịch, cổ phiếu của Genetech đã lập kỷ lục khi lên giá tới 89$, một kỷ lục cho 1 lần đầu tiên chào bán.	1978 Insulin của người được các nhà khoa học của Genetech nhân tách dòng vào E. coli. Genetech sau đó đã chuyển giao công nghệ sản xuất insulin cho Eli Lilly. Năm 1982, insulin người, hay Humulin, trở thành loại thuốc DNA tái tổ hợp đầu tiên được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Hoa Kỳ (FDA) cấp phép	2. Khái niệm về ADN tái tổ hợp	ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) là phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử ADN tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn ADN của các cá thể khác nhau trong cùng một loài hoặc khác loài	Kỹ thuật ADN tái tổ hợp gồm các bước sau	- Nuôi tế bào chủ để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho để cung cấp ADN	- Phân lập gen: Tách chiết ADN plasmid và ADN tế bào cho	- Cắt cả hai loại ADN (plasmid và tế bào cho) với cùng một loại enzym giới hạn	- Trộn hai loại ADN vừa cắt với nhau để chúng bắt cặp	- Bổ sung ligase để tạo ADN tái tổ hợp	- Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng	- Chọn lọc dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp3. Các enzyme của công nghệ ADN tái tổ hợpCó 5 nhóm enzym chính được sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp:	- Nuclease: cắt, phá hủy axit nucleic, bao gồm hai loại là exonuclease (cắt ngoại bào) và endonuclease (cắt nội bào)	- Ligase: Nối các phân tử axit nucleic	- Enzym sửa đổi: thêm hoặc bớt các thành phần hóa học của phân tử axit nucleic	- Topoisomerase: làm biến đổi cấu hình không gian	- Reversre – transcriptase: có khả năng xúc tác sao chép ngược từ ARN thành ADN3.1. Enzyme cắt hạn chế (RE – Restriction endonuclease)	1962, V. Arber phát hiện “enzym hạn chế” sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn và gọi là Restriction endonuclease – RE	1970, H. Smith đã tách được RE từ vi khuẩn Heamophilus influenza và đặt tên là HinII. Ngay sau đó các nhà khoa học đã xác nhận rằng đa số các loài vi khuẩn đều mang loại enzym này để bảo vệ tế bào chống lại sự xâm nhập của các ADN ngoại lai	RE là enzym có khả năng nhận biết những đoạn ADNnhất định và cắt ADN ở tại đó hoặc tại điểm kế cận. 	RE là một loại nuclease đặc biệt	RE có thể cắt tạo ra đầu bằng hay đầu so le	RE cắt ADN tạo ra các đầu bằng hay đầu so lePhân loại RE	Loại I. Vị trí cắt cách xa vị trí nhận biết khoảng 1000 – 5000 base	Loại II. Vị trí nhận biết là vị trí cắt	Loại III. Vị trí cắt cách vị trí nhận biết từ 10 – 20 base3.2. Enzyme nối	Qúa trình nối 2 phân tử ADN với nhau để tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp cần xúc tác bởi enzym nối (ligase)	Ligase xúc tác hình thành liên kết phosphodieste giữa hai chuỗi ADNDNA ligaseDNA ligaseQuá trình nối các đoạn ADN lại với nhau nhờ ligase3. 3. Các enzym khác 	- Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase) tổng hợp ADN từ ARN	- Các enzyme polymerase xúc tác quá trình sao chép của axit nucleic (ADN hoặc ARN): ADN polymerase và ARN polymerase	4. Các vector sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp	Vector chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bàovà mang được các gen cần thiếtVector chuyển gen cần phải có các đặc điểm sau:	- Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép và tồn tại độc lập trong tế bào	- Có trình tự nhận biết của RE	- Có các trình tự promoter xúc tiến quá trình phiên mã 	- Có các dấu chuẩn chọn lọc để cho phép phát hiện chúng trong tế bào chủ nhận. Ví dụ các gen kháng kháng sinh, gen tổng hợp chất màu	- Các đặc điểm khác như: có khả năng tạo nhiều bản sao, có các trình tự cần thiết cho sự biểu hiện gen4.1. Các vector plasmid	Plasmid là những phân tử ADN có kích thước nhỏ (2 – 5 kb), dạng vòng, nằm độc lập trong tế bào chất, có khả năng sao chép độc lập không phụ thuộc vào sự sao chép của ADN nhiễm sắc thể. Các plasmid dùng làm vector tạo dòng có các đặc điểm sau: kích thước tương đối nhỏ, mang một hay nhiều gen chỉ thị chọn lọc	Các plasmid đã được cải tiến qua 3 thế hệ 	- Thế hệ đầu tiên. Là các plasmid tự nhiên đến nay hầu như không còn sử dụng nữa. 	 - Thế hệ thứ hai Là các plasmid đa năng (polycloning plasmid) có chứa vị trí đa tách dòng (vị trí có các vị trí nhận biết cho RE)Plasmids are extrachromosomal self-replicating DNA moleculesPlasmid vector pBR 322 Plasmid thế hệ thứ haiBa loại plasmid được sử dụng rộng rãi:	- Nhóm các plasmid pUC, kích thước khoảng 2600 bp, mang gen Ampr và gen lac Z’, vị trí đa tách dòng xen giữa gen lac Z’	- Nhóm các plasmid pGEM, kích thước khoảng 3000 bp, mang gen Ampr và gen lac Z, vùng đa nối, promoter cho các ARN polymerase	- Nhóm các plasmid pBluecript, kích thước khoảng 3000 bppUC19pGEM – T EasypBluecripts II SK4.2. Các vector phage	Các phage (virus của vi khuẩn) được dùng làm vector chuyển gen do có khả năng mang gen từ tế bào vi khuẩn sang tế bào nhận	Các vector phage phần lớn bắt nguồn từ phage lamda và phage M13	Bacteriophage  là một virus mang DNA sợi đôi có kích thước khoảng 50 kb, DNA của nó ở dạng phân tử mạch thẳng có 2 đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (đầu cos).	M13 là phage dạng sợi với DNA mạch vòng đóng, dài khoảng 6.500 nucleotide. Hình dạng của bacteriophage ĐuôiĐầuVector bacteriophage λ họ EMBL được dùng phổ biến trong tạo dòng genDạng tự nhiên của bacteriophage M13 Vector M13mp (phagemid)4.3. Vector cosmid: 	Cosmid là các vector đặc biệt được xây dựng bởi plasmid + đầu cos của phage λ dùng để tạo dòng các đoạn DNA có kích thước lớn của eukaryote. Các đặc điểm chính vector cosmid 	- Một marker kháng kháng sinh và một locus khởi đầu của plasmid (ori). 	 - Đoạn DNA mang đầu kết dính cos của phage λ. 	- Kích thước nhỏ sao cho các đoạn DNA eukaryote dài trên 45 kb có thể thích ứng.Cosmid vector pWEB-TNCBảng so sánh giữa ba loại vector phổ biến 4.4. Các loại vector khác4.4.1. Plasmid Ti	Được sử dụng rộng rãi trong việc chuyển gen ở thực vật. Bắt nguồn từ vi khuẩn trong đất là Agrobacterium tumifaciens gây bệnh tạo khối u (tumor) ở thực vật. Nhân tố gây khối u là plasmid Ti (Tumor inducing) có DNA vòng, kích thước khoảng 200 kb4.4.2. Vector là nhiễm sắc thể nhân tạo	Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (Yeast Artificial Chromosome – YAC)	Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (Bacterial Artificial Chromosome – BAC)	Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú (Mammalian Artificial Chromosome – MAC)5. Các hệ thống tế bào chủMục đích của tế bào chủ:	- Nuôi số lượng lớn plasmid cho thí nghiệm tạo dòng	- Dùng để biểu hiện gen	- Dùng để sản xuất protein tái tổ hợpGồm hai loại: 	- Tế bào chủ nhân sơ (prokaryote)	- Tế bào chủ nhân chuẩn (eukaryote)5.1. Tế bào chủ nhân sơ	E.coli là vi khuẩn gram âm, hình que, không gây bệnh, thường gặp trong ruột người. Hệ gen dạng vòng, kích thước khoảng 4 x 106 bp	Ngoài E.coli, các vi khuẩn khác cũng được dùng làm vật chủ cho các thí nghiệm tách dòng gen như: Bacillus, Pseudomonas, StreptomycesVi khuẩn Escherichia coliƯu điểm của E.coli	- Đặc điểm di truyền, sinh lý sinh hóa đã được nghiên cứu đầy đủ	- Hệ gen đã được giải trình tự	- E.coli dễ nuôi, chu kỳ sinh trưởng ngắn	- Dòng E.coli được sử dụng hiện nay là dòng K12, không có độc tính đối với người và động vật5.2. Tế bào chủ nhân chuẩn	Nhược điểm khi sử dụng E.coli làm vật chủ để tách dòng là do chúng là sinh vật nhân sơ. Do đó các gen của sinh vật nhân chuẩn không hoạt động được	Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) được sử dụng rộng rãi làm tế bào chủ là vì:	- Là VSV nhân chuẩn, có thể nuôi cấy quy mô lớn	- Có các cải biến sau dịch mã (đường hóa, phosphoryl hóa) để tạo protein có đầy đủ hoạt tính sinh học	- Nấm men rất ít tổng hợp protein trong điều kiện bình thường do đó nếu đưa gen lạ vào tổng hợp protein mới thì sản phẩm rất dễ tinh sạch	- Là vi sinh vật an toàn	- Hệ gen nấm men đã được giải trình tự vào năm 1996, kích thước khoảng 1,35 x 107	Các vi nấm khác cũng được dùng làm tế bào vật chủ trong các thí nghiệm tạo dòng gen như nấm mốc (Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Pichia pastoris) Nấm men S. cerevisiaeCác tế bào chủ thực vật	Ví dụ như loài tảo đơn bào Chlamydomonas reinhardiiCác tế bào chủ động vật	Ví dụ tế bào thận khỉ xanh châu Phi (African green monkey kidney), Tế bào thận chuột đồng nhỏ (Baby hamster kidney), tế bào tuyến trùng (Caenorhabditis elegans)6. Tạo, tách và chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp	Trong phần trước chúng ta đã biết, 2 yếu tố quan trọng trong công nghệ ADN tái tổ hợp là sử dụng enzym để cắt, nối các phân tử ADN in vitro và hệ thống tế bào chủ để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ để nhân lên 	Mỗi tế bào chủ khi nhân lên sẽ tạo nên một dòng chứa bản sao của một gen cần thiết, đó là tách dòng gen (gene cloning)6.1.Quá trình tách dòng gen gồm các bước cơ bản sau	- Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu, xử lý bằng RE	- Gắn vào vector nhân dòng, tạo vector tái tổ hợp	- Biến nạp vào tế bào chủ	- Chọn lọc dòng cần tìmChọn dòng mang DNA tái tổ hợp	Trong thí nghiệm tạo plasmid tái tổ hợp, các dòng vi khuẩn mọc lên có 3 loại như sau:	- Không mang plasmid	- Mang plasmid không có gen lạ (tự đóng vòng)	- Mang plasmid tái tổ hợp	Vector thường mang các dấu chuẩn chọn lọc như các gen kháng kháng sinh và gen tạo màu. Dựa vào các dấu chuẩn đó chọn lọc được các dòng mang DNA tái tổ hợpChọn lọc dựa trên dấu chuẩn là gen lac Z6.2. Biểu hiện của gen được tạo dòng	Muốn gen tạo dòng có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector có các yếu tố phiên mã và dịch mã. Các vector này gọi là vector biểu hiện	Vector biểu hiện là các vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện phiên mã va dịch mã trong tế bào vật chủ nhận. Có các đặc điểm sau:	- Mang các gen chọn lọc	- Trình tự điều hòa (promoter) phiên mã	- Trình tự kiểm soát dịch mã	- Vị trí đa tách dòng	Vector biểu hiện pRSETXác định mức độ biểu hiện	- Điện di polyacrylamid: Điện di trên polyacrylamide gel có mặt sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE) cho phép phân chia các phân tử protein có khối lượng khác nhau.	- Phân tích Western Blot. Dựa trên cơ sở phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể.WM 1 2 3 4 5 6 7Điện di SDS và nhuộm bằng Coomasie blue. WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. Các đường từ 1-7: Các mẫu protein Liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme trong Western blot7. Kỹ thuật PCR	PCR được K. Mullis phát minh năm 1985	Nobel năm 1993	PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq DNA polymerase khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn (thermocycler) còn gọi là máy PCR. 	PCR cho phép khuếch đại (amplification) theo hàm mũ lên đến hàng triệu bản sao các đoạn DNA có chiều dài từ 200 – 3000bp. Đoạn DNA khuếch đại được nhận dạng nhờ các cặp mồi (primer) đặc hiệu thường có chiều dài 20 bpMáy PCRNGUYÊN LÝ CỦA PCRSơ đồ phản ứng chuỗi polymerase PCR thường được thực hiện trong khoảng từ 25-35 chu kỳ.Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ khác nhau:	 Gây biến tính: 90-950C 	 Ủ để gắn primer: 40-650C 	Tổng hợp: 70-720CCác chu kỳ của kỹ thuật khuếch đại PCRANNEALING Gắn mồi37°C - 65°CEXTENSIONMở rộng 72°C25-35 CYCLESDENATURATIONBiến tính 93°C - 95°C DENATURATIONBiến tính 93°C - 95°C Ứng dụng của PCR	- Tách dòng gen	- Là kỹ thuật nề cho các kỹ thuật khác như xác định trình tự gen, phát hiện đột biến gen,...	- Chẩn đoán nhanh, nhậy các bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễmT T TAAPCR productpGEM-T pCR 2.1-TOPO Sơ đồ gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng8. Xác định trình tự gen	 Phương pháp hóa học (Maxam-Gilbert)	Phương pháp enzyme (Sanger)	Phân tích trình tự nucleotide trên máy đọc tự độngWalter Gilbert8.1. Phương pháp hóa học (1977)MAXAM-GILBERT CHEMICAL SEQUENCING (1977)Phân tích trình tự nucleotide bằng phương pháp hóa học (Maxam-Gilbert )Frederick (Fred) Sanger8.2. Phương pháp enzyme (1977)SANGER DIDEOXY SEQUENCINGPhân tích trình tự nucleotide bằng phương pháp enzyme (Sanger)Máy phân tích trình tự nucleotide tự động và hình ảnh điện di các băng DNA phát huỳnh quang quan sát được trên computer8.3. Phân tích trình tự nucleotide trên máy đọc tự độngABI: ABI 377, 310, 3100, 3100 Avant, 3700, 3730Amersham: MegaBace 500, 100Beckman-Coulter: CE2000, 8000Shimatzu: DSQ1000, 2000Automated DNA SequencersTại Việt Nam:	ABI 3100 Avant: Viện CNSH, Viện Vi sinh vật, ĐH Y HN, Viện Vệ sinh dịch tễ TW	ABI 310: ĐHTN, Viện DTNN, ĐH Cần Thơ	ABI 377: Viện KH Hình sự	Pharmacia Biotech ALF: ĐH KHTN HN, ĐH KHTN HCM, ĐH BK HN	Beckman – Coulter CE 2000: Viện Pasteur HCM, HVQY, BV 108ABI sequencersABI sequencersCác cơ sở dữ liệuNCBI (USA); EMBL/EBI (EU); DDBJ (NhËt B¶n)8.4. Lịch sử phân tích hệ genSinh vậtKích thước(Mb)Năm kết thúcSố lượng genVirus HIV9700bp9E.coli4,619974200Nấm men12,119966034Tuyến trùng (Caenorhabditis elegans)97199819099Thực vật Arabidopsis100200025000Ruồi giấm (Drosophila melanogaster180200013061Chuột thí nghiệm Mus musculus2600200230000Người (Homo sapiens)3200200330000 - 35000Dự án hệ gen người	Bắt đầu từ năm 1990, dự kiến kết thúc vào năm 2005, kinh phí 3 tỉ USD. Do Viện Sức khỏe quốc gia của Mỹ điều phối với sự tham gia của các nhà khoa học của nhiều nước	1998, Craig Venter và Perkin Elmer đã liên kết với nhau thành lập Celera Genomics. Mục tiêu: giải trình tự toàn bộ Hệ gen Người vào ngày 31/12/2001, trước 2 năm so với Dự án Hệ Gen Người, với chỉ 300 triệu $. Mục tiêu của dự án:	- Xác định tất cả các gen của người	- Xác định trình tự nucleotide của người	- Lưu trữ thông tin trong dữ liệu	- Cải tiến các công cụ lưu trữ dữ liệu	- Chuyển giao công nghệ cho khu vực tư nhân	- Vạch ra các vấn đề về đạo đức, luật pháp và xã hội của dự án	Ngày 15 và 16/ 02/ 2001: Đồng thời xuất bản hai tạp chí Di truyền nổi tiếng là Nature (Collins và cộng sự, Dự án giải mã Hệ gen Người) và Science (Venter và cs, Celera Genomics). Cả hai tạp chí này đều cung cấp bài báo miễn phí.	Ngày 14/ 04 / 2003: Hoàn thành Dự án Genome Người. Tổ hợp quốc tế Giải mã Genome Người tuyên bố đã hoàn thành xuất sắc dự án giải trình tự Genome Người sớm hơn 2 năm so với kế hoạch. “Dự án Genome