Bài giảng Sinh học - Nuôi cấy sâm ngọc linh thu nhận gisenosides

Nuôi cấy sâm ngọc linh thu nhận gisenosidesThành viên:Đặng Xuân PhongTrần Văn PhongNguyễn Hoàng ÂnNguyễn Duy ĐạiI. Tổng quan về sâm ngọc linhII. Thành phần hóa học sâm ngọc linhIII. Quy trình nuôi cấy sâm ngọc linhIV. Thu nhận ginsenosidesI. Tổng quan về sâm ngọc linh1.Danh phápTên khoa học : Panax vietnamesis Ha et GrushyGiới (regnum): Plantae Ngành (divisio): MagnoliophytaLớp (class):Magnoliopsida Bộ (ordo): Apiales Họ (familia): Araliaceae Phân họ (subfamilia): Aralioideae Chi (genus): Panax Phân chi (subgenus): Panax Nhánh (section): Panax Loài (species): P. vietnamensis 2. Đặc điểm sâm ngọc linhSâm Ngọc Linh mọc tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam trên độ cao 1.500 - 2.200 m. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng,nhiệt độ thích hợp vào ban ngày là 20°C-25°C, ban đêm là :15°C -18°C Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm đến 100cm Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân độ 4-8mm, thường tàn lụi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm. Thân rễ có đường kính 1-2cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất độ 1-3cm, mang nhiều rễ nhánh và củ. II. Thành phần hóa học của sâm.1. Thành phần hóa học của sâmSâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin hay gọi là ginsenosides (saponin có cấu trúc Damaran(với hai đại diện là nhóm protopanaxadiol và nhóm protopanaxadiol) và saponin có cấu trúc olean)Ngoài ra còn 14 axit béo,16 axit amin (trong đó có 8 acid amin không thay thế), 18 nguyên tố đa lượng và vi lượng.Sâm Việt Nam mới có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol với Majonosid R2 chiếm hơn 50% hàm lượng saponin Công thức của Majonosid R2 2. Tác động của sâm đến sức khỏe con người.Tác dụng bổ chung, tăng lực và sinh thích nghi (antistress), phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường mà khái niệm của y học cổ truyền gọi là "hồi dương" Tác dụng chống lão hóa, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào, tăng tạo các tế bào mới Tác dụng kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch, tăng sức đề kháng của cơ thể, phòng và chống lại một số bệnh ung thư (Rh2 và Rg3 ).III. Quy trình nuôi cấy sâm ngọc linhNuôi trong môi trường MSCallus( Mô sẹo đầu tiên)Nuôi trong Erlen 100ml Hệ thống nuôi cấy sinh học(Bioreactor)Thu hồi sản phẩmKhử trùngCắt mẫu-Ta chọn những rễ sâm đã trưởng thành (khoảng trên 5 năm) cắt rễ làm mẩu. Khử trùng mẩu với ethanol 70% sau đó ngâm toàn bộ mẫu trong dung dịch sodium hypochlorite khoảng 15 phút, cuối cùng rửa dưới vòi nước cất khoảng 5 phút. - cho mẫu vào trong đĩa petri chứa môi trường MS có bổ sung thêm 0.5mg/l 6-benzyl-aminopurine (BAP), 3mg/l 1-naphaleneacetic acid (NAA) và 30g đường sucrose, nuôi trong điều kiện nhiệt độ 250C trong tối. Đặc biệt pH của môi trường phải điều chỉnh ở mức 5.8 trước khi đem khử trùng, khử trùng ở 1210C trong 15 phút.- khi mô sẹo được hình thành. Cắt mo sẹo chuyển sang môi trường SH. Kích thước mô sẹo cắt khoảng 1cm, cho vào erlen chứa khoảng 40ml môi trường SH. Đồng thời môi trường SH bổ sung thêm 0.5mg/l BAP, 3mg/l NAA, 30g/l đường sucrose. Đưa erlen vào nuôi trong tối nhiệt độ là 250C với tốc độ lắc là 60 vòng/phút. - pH của môi trường ta có thể điều chỉnh ở 5.0, 5.5, 6.5, 7.0, trước khi đưa môi trường vào khử trùng. Nồng độ đường, nitrogen, photphate điều chỉnh ở khoảng 1-9%, 127.6-1148 mg/l và 26.9-242.1mg/l.  Mô sẹo hình thành:- Ngoài ra ta có thể nuôi mô sẹo trong bioreacor. Cắt ở mô sẹo một dài khoảng 2mm đường kính 0.5cm cho vào bioreactor đã chứa môi trường SH.Tiến hành nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 250C, độ ẩm 70- 80%, cường độ chiếu sáng là 45 mol.m-2.s-1.với chu kỳ chiếu sáng là 10h/ ngày.Thành phần môi trường MS(1962)2-Môi trường SH(1972):Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lựơng saponin pHb. Nồng độ đường c. Nồng độ nitrogend. Nồng độ photphateIV. Thu nhận ginsenosides2kg mẫu dung dịch methanol 80% làm bay hơi huyền phù bằng nước cho ete vào(ethyl ete) làm bay hơi lớp nước chuyển vào cột sắc kýCác giếng:Nước30% KOH (7g)50% KOH (13g)80% KOH(174g)KOH + acetonQuá trình tách chiết ở KOH 80% thì thu được hàm lượng cao nhất saponin.+ 20(s) protopanaxdiol+ 20(s) protopanaxtriol+ ocotillol