Nuôi cấy mô – Tế bào thực vật trong in vitro

Chủ đề: NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG IN VITRO Lịch sử nuôi cấy  mô tế bào -Giai đoạn khởi xướng( 1898- 1930): Haberlandt(1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thưc vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào dựa trên thuyết tế bào của Schleiden-SchwannGiai đoạn nghiên cứu sinh lý(1930-1950):Bắt đầu với công trình của White(1934) nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiết nấm men1935 Thimann đã phát hiện ra auxin(IAA) trong mô thực vật. Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các vitamin bổ sung vào môi trương nuôi cấy đã thu được kết quả tốt.Những năm 1940 nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bàoGiai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái(1950-1960) 1954-1955 Skoog phát hiện kinentin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào. 1956 Skoog và Miller tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá1960 Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏngGiai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực vật(1960 đến nay)1960 Cooking đã dùng enzym cellulase phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật thu được tế bào không vỏ gọi là tế bào trần1968 Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấnTừ 1977 Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây lai khoai tây-cà chuaTừ năm 1980 hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công bốNgày nay nuôi cấy mô tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh học hiên đại mà còn là công cụ quan trong trong chon tạo nhân giống, đóng góp cơ sơ ly luận mới cho sinh học hiên đạiKHÁI NIỆMNuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.CƠ SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀOTính toàn năng : - Tế bào bất kì của cơ thể simh vật nào cũng mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó,khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cá thể hoàn chỉnhTùy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ chế điều hòa hoạt động của gen).SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PHẢN PHÂN HOÁ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ-TẾ BÀOPhân hóa: 1 tế bào,1khối tế bàophân hóa tạo mô cơ quan hệ cơ quan.Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi.Sự trẻ hoá - Khả năng ra chồi,rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau - Trong nuôi cấy invitro các bộ phận non trẻ sẽ ra chồi,rễ tốt hơn các bộ phận trưởng thànhCÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT:Đảm bảo điều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm phải chuyên hóa cao.Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách.Chọn mô cấy, xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.C¸c ®iÒu kiÖn cÇn thiÕt cña nu«i cÊy m« - tÕ bµo thùc vËt.Phßng thÝ nghiÖm. Bố trí theo sơ đồ:Phòng chuẩn bị và giữ môi trường  Phòng cấy  Phòng nuôi câyM«i tr­êng vËt lý.¸nh s¸ng: Bao gåm: + ChÊt l­îng ¸nh s¸ng + Thêi gian chiÕu s¸ng + C­êng ®é chiÕu s¸ngNhiÖt ®é: ThÝch hîp nhÊt lµ 25 0C.M«i tr­êng ho¸ häcHÇu hÕt c¸c lo¹i m«i tr­êng nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt ®Òu bao gåm:C¸c lo¹i muèi kho¸ng ®a l­îng vµ vi l­îng, nguån cacbon, vitamin, c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng, c¸c nhãm chÊt bổ sung, chất độn  C¸c nguyªn tè kho¸ng ®a l­îng.-Nit¬ (N): d¹ng NO-3 vµ NH+4 riªng rÏ hoÆc phèi hîp víi nhau -Phètpho (P): th­êng ë d¹ng ortophotphat hoÆc ®­êng phètpho.-L­u huúnh (S): ë d¹ng muèi SO4-2 víi nång ®é thÊp-C¸c ion Na+ vµ Cl- cÇn ë nång ®é thÊp C¸c nguyÕn tè kho¸ng vi l­îng.-S¾t (Fe): thiÕu s¾t tÕ bµo mÊt kh¶ n¨ng ph©n chia -Mangan (Mn): ThiÕu Mn kÐm ph©n bµo. - Bo (B): ThiÕu B trong m«i tr­êng g©y nªn biÓu hiÖn nh­ thõa auxin v× thùc tÕ Bo lµm cho c¸c chÊt øc chÕ auxin oxydase trong tÕ bµo gi¶m. M« nu«i cÊy cã biÓu hiÖn m« sÑo ho¸ m¹nh, nh­ng th­êng lµ lo¹i m« sÑo xèp, mäng n­íc, kÐm t¸i sinh.C©y in vitro sèng chñ yÕu theo ph­¬ng thøc dÞ d­ìng, mÆc dï d­íi ¸nh s¸ng nh©n t¹o chóng cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh diÖp lôc vµ quang hîp nh­ng bÞ h¹n chÕ cho nªn viÖc ®­a vµo m«i tr­êng nu«i cÊy nguån c¸c bon d­íi d¹ng h÷u c¬ lµ b¾t buéc, gióp cho tÕ bµo ph©n chia vµ t¨ng sinh khèi. Tuú thuéc môc ®Ých vµ sù ®ßi hái cña tõng hÖ m« cã thÓ dïng c¸c lo¹i ®­êng kh¸c nhau: Sucrose, Maltose, Glucose, Galactose vµ Lactose. Hµm l­îng ®­êng bæ sung vµo m«i tr­êng nu«i cÊy th­êng lµ 20 - 40 g/l. C¸c vitamin.C¸c lo¹i m« vµ tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy in vitro ®Òu cã kh¶ n¨ng tù tæng hîp ®­îc hÇu hÕt c¸c lo¹i vitamin, nh­ng th­êng kh«ng ®ñ vÒ l­îng nªn ph¶i bæ sung thªm tõ bªn ngoµi vµo, ®Æc biÖt lµ c¸c vitamin nhãm B. - Vitamin B1 (thiamin) ®ãng vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh biÕn ®æi cacbon vµ tham gia vµo thµnh phÇn tæ hîp enzym xóc t¸c qu¸ tr×nh oxy ho¸ khö cacbon ë axit h÷u c¬. Nång ®é th­êng dïng tõ 0,1- 10 mg/l. - Vitamin B6 (piridoxin) tham gia vµo thµnh phÇn c¸c enzym khö cacbon vµ thay ®æi vÞ trÝ nhãm amin trong c¸c axitamin. Nång ®é dïng tõ 0,1 - 1 mg/l. Myo - inositol cÇn ®­îc bæ sung mét l­îng kh¸ lín tõ 50 - 500 mg/l vµ tá ra cã t¸c dông rÊt râ ®Õn sù ph©n chia cña m«. C¸c chÊt bæ sung: Bao gåm n­íc dõa,dÞch chiÕt nÊm men,chÊt ®énNguồn cacbonCác chất điều hoà sinh trưởngChất điều hoà sinh trưởng gồm có các phytohormone và các chất điều chỉnh sinh trưởng tổng hợp nhân tạo.Phytohormone là các chất hoá học được thực vật tổng hợp với một lượng rất nhỏ ở các bộ phận, cơ quan nhất định và được vận chuyển đến các cơ quan, bộ phận khác để điều hoà các quá trình sinh lý trong cây, đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận.AuxinAuxin - hormone kích thích thực vật sinh trưởng Auxin được định nghĩa là chất có hoạt tính sinh học giống với IAA:kích thích kéo dài các tế bào lá bao mầm và lát cắt thân cây tách rời.cùng với cytokinin kích thích sự phân chia của các tế bào mô sẹo (callus culture).kích thích hình thành rễ từ lá và thân cây tách rời.kích thích một số hiện tượng sinh trưởng và phát triển khác tượng tự như hoạt tính của IAA.Kích thích sự hình thành,sự sinh trưởng của quả và tạo qủa không hạtGây ra tính hướng động của cây,kìm hãm sự rụng lá,hoa,quảTrong cây được tổng hợp ở mô non, đặc biệt lá đang phát triển và vùng đỉnh sinh trưởngGibberellinHiện đã xác định được 136 GA, chúng có cấu trúc hoá học khác nhau song có đều có bộ khung gibberellaseGA được đặt tên theo thứ tự phát hiện: GA1, GA2,..., GAn, trong đó GA3 là loại được phân tích cấu trúc đầu tiên, đây cũng là loại GA có hoạt tính mạnh và được ứng dụng rộng rãi.Gibberellin - chất điều hoà phân chia tế bào thực vậtTrao đổi gibberellinTổng hợp : Các GA bản chất là các acid diterpene được tổng hợp bằng con đường terpenoid trong lạp bào, sau đó được biến đổi hoá học trong lưới nội chất và tế bào chất cho tới khi hoàn thiện cấu trúc để trở thành dạng hoạt động GA được tổng hợp Trong phôi đang sinh trưởng, lá non, rễ non, quả non;Chủ yếu trong lục lạpVận chuyển không phân cực trong xylem và phloem hay giữa các tế bào cạnh nhauCó thể liên kết với đường (thường là glucose) trở thành dạng không hoạt độngGA khá bền vững trong cây, ít bị phân huỷCơ chếSự sinh trưởng kéo dài của thân:GA kích thích sự kéo dài của tế bào (không bằng cơ chế sinh trưởng acid như auxin), tuy nhiên trong thực tế GA luôn xuất hiện cùng auxin  có thể tác dụng kéo dài của GA phụ thuộc vào auxin.GA kích thích sự phân chia tế bào bằng cách khởi động một số gene CDK (cyclin-dependent protein kinase) có vai trò trong điều hoà chu trình tế bào (chuyển tế bào từ pha G1 sang pha S).Hiệu quả sinh lýKích thích sự sinh trưởng kéo dài của thân (được xác định do vai trò của GA1)Sinh trưởng các đột biến lùn (thiếu gene chịu trách nhiệm tổng hợp enzyme trong con đường tổng hợp GA)Hiệu quả sinh lýKích thích sự nảy mầm của hạt, củKích thích sự vươn dài của các gióng cây họ lúaKích thích sự ra hoaỨc chế phát triển hoa cái, kích thích phát triển hoa đực	Hiệu quả sinh lýCytokininCytokinin - chất điều hoà phân chia tế bào thực vậtCytokinin được định nghĩa là những chất hoá học có hoạt tính giống với trans-zeatin kích thích phân chia tế bào mô sẹo kích thích hình thành rễ/chồi trong mô sẹo làm chậm quá trình già hóa của lá kích thích phát triển của lá mầm Về cấu trúc, đa số cytokinin có dạng purine được thay thế N tại vị trí C6Zeatincytokinin là những dẫn xuất từ tARN thực vật, chúng được tổng hợp trong hệ rễ, rồi được vận chuyển không phân cực trong xylem lên ngọn. Ngoài ra chúng còn được tổng hợp ở chồi, lá non, quả non, tầng phát sinhcytokinin trong thực vật có thể ở dạng tự do hoặc liên kết, chúng nhanh chóng bị chuyển hoá nhờ các enzyme oxidase thành adenine rồi theo con đường chuyển hóa adenin để tái sử dụng trong cơ thể hoặc phân giải thành sản phẩm cuối cùng là urea.Cytokinin được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quanTác động phối hợp của Auxin và Cytokinin có tác dụng quyết định sự phân hoá của mô theo hướng tạo rễĐiều hoà sự phân hóa cơ quanauxin/cytokinin cao  kích thích ra rễauxin/cytokinin thấp  kích thích nảy chồiChän vËt liÖu nu«i cÊyT¹o chåiKhö trïngT¹o rÔCÊy c©y vµo m«i tr­êng thÝch øngS¬ ®å : quy tr×nh nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« TB 1. Quy tr×nhTrång c©y trong v­ên ­¬mB­íc 1B­íc 2B­íc 3B­íc 4B­íc 6B­íc 5Quy tr×nh tæng qu¸t c«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt in-vitro - §Ønh chåi, ®Ønh rÔ : lµ bé phËn non, dÔ tham gia vµo qu¸ tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ t¹o nªn c¬ thÓ míi.Th­êng Ýt nhiÔm bÖnh.B­íc 1: Chän vËt liÖu nu«i cÊyB­íc 2 : Khö trïng Buång khö trïngB­íc 2 : Khö trïng - MÉu vµ dông cô ®­îc tÈy röa khö trïng. - C¾t ®Ønh sinh tr­ëng thµnh phÇn tö nhá, tÈy röa, khö trïng ë buång v« trïng. VD: - VËt liÖu nu«i cÊy tiÕn khö trïng víi HgCl 0,1% vµ n­íc cÊt. - Que cÊy, èng nghiÖm vµ gi¸ thÓ®­îc khö trïng trong nåi hÊp.B­íc 3 : T¹o chåiKhèi callus chuÈn bÞ t¹o c©y conC©y con míi ®ang h×nh thµnhB­íc 3 : T¹o chåi - §Ó c©y cã thÓ ph¸t triÓn th©n cµnh - C¾m vËt liÖu nu«i cÊy trong m«i tr­êng dinh d­ìng cã bæ sung thªm xytokinin ho¹t ho¸ t¹o chåi.B­íc 4 : T¹o rÔ - Khi c©y ®¹t tiªu chuÈn vÒ chiÒu cao, sè l¸ th× chuyÓn sang MT t¹o rÔ. §ã lµ MT dinh d­ìng thÝch hîp bæ sung chÊt KT auxin, IBA T¹o rÔB­íc 5 :CÊy c©y vµo m«i tr­êng thÝch øng - ChuyÓn c©y sang MT thÝch øng gÇn gièng víi MT tù nhiªn vÒ: nhiÖt ®é, ®é Èm, ¸nh s¸ng... - Kh«ng thÓ bá qua b­íc nµy ®­îc v× c©y míi t¹o ra rÊt yÕu. NÕu trång trùc tiÕp vµo MT tù nhiªn c©y sÏ dÔ nhiÔm bÖnh vµ chÕt.B­íc 5 :CÊy c©y vµo m«i tr­êng thÝch øngB­íc 6: Trång c©y trong v­ên ­¬m - Cho c©y thÝch øng víi MTSX. - Khi c©y ®ñ chiÒu cao, th©n l¸ th× chuyÓn c©y ra v­ên ­¬m nh©n nhanh SX.Quy tr×nh nh©n gièng Lan b»ng nu«i cÊy m« in-vitro Các phương thức nuôi cấy mô tế bào thực vậtNuôi cấy mô thực vật trên môi trường cứngNuôi cấy huyền phù tế bàoNuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi trường cứngTái sinh chồi trực tiếp từ mẫu mô nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy: Chủ yếu là những khối mô và cơ quan tách rời:mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng,mảnh lá,..Các bước tiến hành: + Lựa chọn vật liệu + Khử trùng vật liệu nuôi cấy + Cấy vào môi trường mẫu + Nhân nhanh chồi + Chuyển sang môi trường tạo rễ,tạo cây hoàn chỉnhTái sinh chồi gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo(callus)Bao gồm các bước:+Lựa chọn vật liêu+Khử trùng vật liệu nuôi cấy+Vào mẫu môi trường: Không bật chồi trực tiếp mà tạo mô sẹo hoặc protocom Nhân nhanh mô sẹo hoặc protocom Cho mô sẹo hoặc protocom tái sinh tạo chồi+Nhân nhanh chồi+Tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh+Đưa cây ra môi trường ngoàiNuôi cấy huyền phù tế bàoNuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng Thường được khởi đầu bằng cách đặt các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Nuôi cấy dịch huyền phù vì thế là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới dịch huyền phù. Nuôi cấy dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus, do nuôi cấy dịch huyền phù có thể duy trì và được thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật được ngập chìm trong môi trường lỏng.Các phương pháp nuôi cấyhuyền phù tế bào+Nuôi cấy dịch thể tĩnh: Chỉ áp dụng với 1 số trường hợp nghiên cứu và 1 số thí nghiệm+ Nuôi cấy dịch thể động: Mẫu nuôi cấy được thả trực tiếp vào môi trường dịch thể,song phải có biện pháp sục khí vào môi trường.Phương pháp này chủ yếu tạo mô sẹo và phôi soma Có 2 phương pháp: * Chìm liên tục ( tuần hoàn ): Mẫu nuôi cấy lúc nào cũng chìm trong dịch thể,phải dùng thiết bị khuấy từ * Chìm không liên tục ( không tuần hoàn ) : Sử dụng hệ thống bập bênh Xác định tốc độ sinh trưởng tế bào+Xác định số lượng tế bào: Đếm dưới kính hiển vi *Lấy 1 thể tích dịch thể nhất định có chứa tế bào * Tách riêng rẽ các tế bào bằng dd cloromium trioxide ( 5-10% W/v ), đồng thời đun nóng ở 700C trong 5’-10’ đủ để gây ra sự phân tách các tế bào nhưng chưa làm phân huỷ tế bào,sau đó làm nguội và lắc mạnh * Pha loãng huyền phù tế bào đến nồng độ phù hợp,nhuộm và đếm trong buồng đếm tế bào Từ đó tính được số tế bào trong 1ml dd cấy+ Xác định thể tích tế bào: Lấy ngẫu nhiên 1 lượng thể tích nuôi cấy dd huyền phù sau đó đem ly tâm (thường 200 vòng/p ) trong 5’,thu lấy tế bào rồi đo thể tích của tổng khối tế bào +Xác định khối lượng tế bào khô,tươi : Ứng dụng đẻ thu chất thứ cấpÝ nghĩa khoa học- Tạo ra 1 quần thể cây con đồng đều giữ nguyên đặc tính của cây mẹ- Hệ số nhân nhanh cao- Rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất và phát huy được hiệu quả kinh tế- Nhân được số lượng cây lớn trong 1 diện tích nhỏ- Đảm bảo các cây giống sạch bệnh- Cây con được tạo ra nuôi cấy mô được trẻ hoá cao độ- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển- Bảo quản cây giống thuận lợiỨng dụng trong thực tiễnNhân cây giống,tạo cây giốngSản xuất chất thứ cấp + Chất thứ cấp ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm: chất tạo mùi,màu,chất ngọt + Chất thứ cấp ứng dụng trong dược phẩm: ankanoid,steroid,các chất riêng lẻ khác ( ubiquinon,saponin ),các protein tái tổ hợpMột số ứng dụng trong thực tiễnLàm sạch virut qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh*Nguyên lý: - Nồng độ virut giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng do: + virut không vận chuyển được trong mô phân sinh đỉnh + Các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sự sao chép thông tin di truyền cua virut + Hệ thống vô hiệu hoá virut ở mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác + Nồng độ auxin cao ngăn cản quá trình sao chép của virut*Các kĩ thuật làm sạch virut in vitro + Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh : Bao gồm các phương pháp: - Nuôi cấy mô phân sỉnh đỉnh kết hợp với xử lí ở nhiệt độ cao - Nuôi cấy mô phân sỉnh đỉnh kết hợp với xử lí hoá chất - Kĩ thuật vi ghépChọn dòng biến dị somaCơ sở chọn dòng biến dị soma: là chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào,mô nuôi cấy,cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô tế bàoGồm 2 nhóm chính: Biến dị kiểu gen và biến dị kiểu hìnhCác nguyên nhân gây biến dị dòng soma + Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy + Phương thức nhân giống in vitro + Loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng + Thời gian nuôi cấy và số lần cấy chuyểnPhương pháp chọn dòng biến dị soma + Chọn trực tiếp + Chọn gián tiếp + Chọn tổng thể